[发明专利]测定糖化蛋白质的组合物

说明书

本申请是中国专利申请02806704.5(其分案申请的申请号200810144943.6)的分案申请，原申请的申请日是2002年1月30日，发明名称是“测定糖化蛋白质的组合物”。

发明领域

本发明涉及一种用于测定糖化蛋白质的组合物和一种测定糖化蛋白质的方法。可将本发明用于测定糖化蛋白质的组合物和方法应用于临床检查，其能够精确地测定糖化蛋白质。

发明背景

在糖尿病的诊断和控制中测定糖化蛋白质是非常重要的。对能够反应过去约1至2个月的平均血糖值的糖化血红蛋白(GHb)，能反应过去约2周的平均血糖值的糖化清蛋白(GA)，一般地指示血清中具有还原能力的糖化蛋白的果糖胺(FRA)等可每天进行测定。GHb是血红蛋白的糖化产物，即在血红蛋白β-链上N-末端缬氨酸的α-氨基基团被糖化。GA和FRA分别是清蛋白和血清蛋白的糖化产物，即清蛋白或血清蛋白的赖氨酸残基上的ε-氨基基团被糖化。

酶学方法是一种简易且便宜的精确测定糖化蛋白质的方法。日本专利申请公开No.6-46846，No.5-192193，No.2-195900和No.2-195899，以及国际专利申请公布号WO98/48043和WO97/13872是公开此酶学方法的文献实例。

然而，为提供一种精确测定糖化蛋白质的组合物，有必要1)消除球蛋白组分和抗坏血酸的影响以及2)使蛋白酶和能够至少与糖化氨基酸反应的酶保持稳定。此外，如果糖化蛋白是糖化清蛋白，则3)精确测定清蛋白和4)消除糖化血红蛋白的影响也很重要。

1)消除球蛋白组分和抗坏血酸的影响的常规方法

已知糖尿病患者的球蛋白的量能够改变和影响FRA的值[Rodrigues，S.等，临床化学(Clin.Chem.)35：134-138(1989)]。本发明人研发了一种方法，其中通过向蛋白酶反应液中加入特定金属离子和蛋白质A或G可选择性地抑制蛋白酶对球蛋白组分的作用(日本专利申请No.11-231259)。利用此发明的方法，可以测定糖化蛋白而不会受到球蛋白组分的影响。应用于此方法中的球蛋白选择性蛋白酶抑制剂可提及的有金属、蛋白A和蛋白G。在此专利申请所述的金属中，强效金属是那些可能会导致环境安全问题的重金属。而弱效金属如果与其它试剂(或组合物)结合可能导致试剂溶液浑浊。另外，蛋白A和蛋白G都是非常昂贵的试剂。

作为选择性吸附血液中球蛋白的方法，已知血液处理剂利用色谱学原理以及具有类固醇骨架的引入了配体的乙烯共聚物可对血液中的内毒素和球蛋白进行吸附(日本专利申请公开No.61-94663)。然而，在日本专利申请公开No.61-94663的实施例中附表1所示的结果表明只有α1-球蛋白和α2-球蛋白被证明可被吸附，而占球蛋白组分70％或更多的γ-球蛋白不能被吸附。假设γ-球蛋白被吸附，则不会期望血液处理试剂具有抑制蛋白酶对γ-球蛋白的作用的能力。

近年来，大量抗坏血酸作为增补物被摄取的情况越来越多。含有高浓度抗坏血酸的临床样品也在增加。抗坏血酸由于具有强还原性而对临床检查造成多种影响。

作为消除抗坏血酸影响的方法，已知可通过化学或利用抗坏血酸氧化酶的酶学方法去除样品中的抗坏血酸。从对显色系统引起较小影响来考虑，当利用至少与糖化氨基酸反应的酶对利用蛋白酶断裂糖化蛋白质所产生的糖化氨基酸进行检测时，优选预先地在与蛋白酶反应时利用抗坏血酸氧化酶(ASOx)去除抗坏血酸的方法。

作为蛋白酶存在时利用ASOx去除样品中抗坏血酸的实例，对在pH8.0的2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]-乙磺酸(HEPES)缓冲液中使ASOx与样品溶液反应的实验已有报道(Clinical Chemistry(临床化学)，27：99-106，1998)。文献报道经过两周的冷藏后处理抗坏血酸的能力没有变化。

然而，本发明人的研究表明当HEPES缓冲液(pH8.0)、蛋白酶和ASOx存在时，在37℃下贮藏一天或在10℃下贮藏两周后抗坏血酸处理能力已经几乎完全丧失。

2)用于稳定蛋白酶和至少与糖化氨基酸反应的酶的现有技术

用于糖化蛋白质的临床检测的蛋白酶溶液具有在其它领域如食品业中无法见到的极高浓度。已知蛋白酶在水溶液中能进行自消化。难以想象蛋白酶能以如此高浓度在水溶液中保持稳定。因此，在用于鉴定糖化蛋白的组合物中使用的蛋白酶以冻干产物形式提供。