[发明专利]一种用于转基因大豆检测的两基因标准质粒分子及其构建

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种分子生物学技术领域的质粒分子，具体来说，涉及一种转基因大豆检测用标准质粒分子及其构建方法。 

背景技术

自1996年以来，全球转基因作物种植面积以年均10％以上的速率增长，2009年全球批准种植的转基因作物达1.34亿公顷，其中转基因大豆种植面积达到6900万公顷，占大豆总种植面积的77％。随着转基因作物的广泛种植，其安全性问题引起了全球公众的普遍重视。欧盟于1998年在世界上签署第一个法案，要求对转基因产品进行标签说明；1999年要求出口到欧盟的非转基因产品不得含有1％的转基因产品污染；2002年，欧盟将标识的最低限量降低到0.9％。随之，日本、澳大利亚、韩国等国家对转基因成分的最低含量做了不同的规定，阈值从1-5％不等。我国于2001年5月23日发布了《农业转基因生物安全管理条例》，2002年1月5日公布了农业转基因生物安全评价、标识和进口安全管理三个配套管理办法，确定了第一批实施标识管理的农业转基因生物目录，并于2002年3月20日起正式实施。 

标识制度的实施依赖于转基因产品检测技术。目前主要有两类技术：一类是基于核酸方法，如PCR、基因芯片等，另一类是基于蛋白质方法，如ELISA、试纸条等，在这些检测方法中，PCR方法因具有高灵敏度和特异性强的优点，已成为目前最重要、应用最广泛的转基因作物及其产品检测技术。 

在进行PCR检测时，需要设置阳性对照以确保检测过程的有效性和检测结果的可靠性，特别是在定量PCR检测中需要用含量准确的转基因作物阳性标准品(CRMs)来制作标准曲线。然而，由于转基因作物存在生物安全性和和现有技术的限制，转基因作物阳性标准品很难获得，这种现状已成为检测方法和应用的瓶颈。因此亟需研制能够替代转基因作物标准物质的新型阳性对照材料，以满足不断发展的转基因检测需求。 

标准分子的概念由日本科学家Kuribara等于2002年提出，它是指一种含有转基因检测目的外源基因和/或内标准基因的特异性片段的线性化重组质粒分子，研究表明质粒标准分子在GMO鉴定检测中是很好的标准物质替代物。近年来，国内外众多学者报道了一些用于转基因产品检测的标准质粒分子。标准质粒分子的容量也有一个大的提升，从最初的单一目标基因的质粒分子到多目标基因的质粒分子，这些质粒分子可同时涉及不同物种的转基因作物的多个基因。 

发明内容

本发明一个目的在于提供一种用于转基因大豆检测的标准分子对照物及其构建方法，这样就为解决阳性标准品缺乏问题提供一条有效途径，有效地保证检测工作的进行。 

为实现上述目的，本发明提供一种转基因大豆检测用标准质粒分子，其特征在于，通过特异性PCR引物，从转基因大豆GTS40-3-2基因组DNA中扩增出大豆内源基因Lectin 1特异性序列、外源基因EPSPS基因特异性序列，经过与中间载体的连接、酶切、转化，将插入这两个特异性片段依次插入到质粒载体pMDTM19-T Simple中，获得了标准质粒分子pTLE2。 

本发明所述标准质粒分子，以替代转基因大豆品系GTS40-3-2和转PAT大豆，用于定性和定量PCR检测。该标准质粒分子同时含有大豆内源基因Lectin和外源基因EPSPS的一段序列。 

本发明所述的一种转基因大豆检测用标准质粒分子及其构建方法，包括以下步骤： 

(1)利用GenBank数据库进行生物信息学分析，查找并获得大豆内源基因Lectin、转基因大豆品系GTS-40-3-2外源基因EPSPS的特异性序列； 

(2)根据Lectin基因序列、EPSPS基因序列利用Primer Premier 5.0软件设计PCR特异性定性引物，分别扩增这两个基因； 

(3)分别回收Lectin基因和EPSPS基因的定性PCR产物，将这两个基因PCR回收产物构建到质粒载体pMDTM19-T Simple上获得中间质粒分子pMDLEC和pMDEPS； 

(4)将中间质粒分子pMDLEC和载体pET30a分别用限制性内切酶Not Ⅰ和Sal Ⅰ进行双酶切，回收目的基因片段及载体片段，用T4 DNA连接酶连接获得质粒分子pETLEC； 

(5)将中间质粒分子pMDEPS和pETLEC分别用限制性内切酶EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ进行双酶切，回收这两种酶切产物，用T4 DNA连接酶连接获得质粒分子pETLE2； 

(6)以质粒分子pETLE2为模板，用Lec-P1和Eps-P2引物扩增获得Lec-Eps区扩增子序列；