[发明专利]一种用于转基因大豆检测的两基因标准质粒分子及其构建无效
| 申请号： | 201010286872.0 | 申请日： | 2010-09-20 |
| 公开（公告）号： | CN102409080A | 公开（公告）日： | 2012-04-11 |
| 发明（设计）人： | 王建华;王秀敏;滕达;杨雅麟 | 申请（专利权）人： | 中国农业科学院饲料研究所 |
| 主分类号： | C12Q1/68 | 分类号： | C12Q1/68;C12N15/63;C12N15/66 |
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| 地址： | 100081 北*** | 国省代码： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 用于 转基因 大豆 检测 基因 标准 质粒 分子 及其 构建 | ||
1.一种用于转基因大豆检测的两基因标准质粒分子及其构建，其特征在于，含有大豆内源基因特异性序列Lectin 1和转基因大豆品系GTS40-3-2外源基因EPSPS特异性序列。
2.根据权利要求1所述的转基因大豆检测用标准质粒分子，其特征是，所述的大豆内源基因Lectin指的是大豆凝集素基因，其在大豆基因组中高度保守，具有种间特异性、种内非特异性和单拷贝数的特点；所述的EPSPS基因是指5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因(EPSPS)。
3.根据权利要求1所述的转基因大豆检测用标准质粒分子，其中Lectin 1和EPSPS标准分子的引物序列如下：
4.一种如权利要求1所述的转基因大豆检测用标准质粒分子的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)利用GenBank数据库进行生物信息学分析，查找并获得大豆内源基因Lectin 1、转基因大豆品系GTS-40-3-2外源基因EPSPS的特异性序列；
(2)根据Lectin 1基因序列、EPSPS基因序列利用Primer Premier 5.0软件设计PCR特异性定性引物，分别扩增这两个基因；
(3)分别回收Lectin 1基因和EPSPS基因，将这两个基因PCR回收产物构建到质粒载体pMDTM19-T Simple上获得中间质粒分子pMDLEC和pMDEPS；
(4)将中间质粒分子pMDLEC和载体pET30a分别用限制性内切酶Not Ⅰ和Sal Ⅰ进行双酶切，回收目的基因片段及载体片段，用T4 DNA连接酶连接获得质粒分子pETLEC；
(5)将中间质粒分子pMDEPS和pETLEC分别用限制性内切酶EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ进行双酶切，回收这两种酶切产物，用T4DNA连接酶连接获得质粒分子pETLE2；
(6)以质粒分子pETLE2为模板，用Lec-P1和Eps-P2引物扩增获得Lec-Eps区扩增子序列；
(7)将Lec-Eps区扩增产物回收连接到载体pMDTM19-T Simple上获得质粒分子pTLE2。
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