[发明专利]O139群霍乱弧菌检测用组合物、试剂盒和检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及霍乱弧菌的特异性检测用组合物、试剂盒和检测方法，特别涉及O139群霍乱弧菌的特异性检测用组合物、试剂盒和检测方法。 

背景技术

霍乱是由霍乱弧菌(Vibrio chlorae)引起的烈性肠道传染疾病，患者的临床症状常表现为大量米汤状排泄，造成迅速脱水。如不及时治疗，可导致低血容量休克、酸中毒，甚至致人死亡。霍乱弧菌按照血清型可分为多个群，但是并不是所有的群都能引起疾病的流行。其中，能够引起霍乱流行的主要有两种血清型：O1群和O139群(Kaper JB，Morris JG，Levine MM.Cholera.Clin.Microbiol.Rev，1995，8：48-86)。因此在霍乱弧菌的检测中，其血清型分型是有效检测的重要组成部分。 

就其致病性检测指标来说，早期研究发现，霍乱的强致病作用主要是因为霍乱弧菌分泌的霍乱毒素导致的腹泻所致。因此在O139群霍乱弧菌引发的霍乱出现之前，一直使用霍乱毒素(cholera toxin，CT)作为检测其病原性的标准。历史上的前7次霍乱流行都由O1群霍乱弧菌引发。在1992年末，在印度出现了由O139群引发的霍乱，并迅速传至周围国家。自从O139群霍乱弧菌引发霍乱爆发以后，并且随着对O139群和O1群霍乱弧菌研究的深入，发现有一些非O139群也非O1群的霍乱弧菌也表达霍乱毒素CT，但是并不会引发霍乱的爆发。同时，在偶然情况下O1和O139群霍乱弧菌由于缺失ctx基因而不表达霍乱毒素，同时也不会引发霍乱的爆发。所以，要准确检测致病性霍乱弧菌的存在需要同时检测两个指标：霍乱毒素CT和血清型指标(Chakraborty S，Mukhopadhyay AK，Bhadra RK，et al.Virulencegenes in environmental strains of Vibrio cholerae.Appl.Environ.Microbiol，2000，66：4022-4028)。 

鉴于霍乱流行的危害性较大，使霍乱弧菌的检测尤为重要。但是传统的弧菌检测法需要先用碱性蛋白胨培养液培养增菌，培养分离出菌株之后才能检测，由于其对菌株培养的需要，使这种传统检测方法并不总是适用。因为霍乱弧菌在严苛的生存条件下，例如抗生素、营养素缺乏、气候寒冷等，就会进入一种可存活但不可培养的状态，不适于基于菌株培养的传统检测方法(Lyon WJ.TaqMan PCR for detection of Vibrio cholerae O1，O139，non-O1，and non-O139 in pure cultures，raw oysters，and synthetic seawater.Appl.Environ.Microbiol，2001，67：4685-4693)。并且，传统弧菌检测方法耗时较长，不利于对样品的迅速检测处理。由于传统的霍乱弧菌检测方法费时费力，不利于快速检测，并且涉及菌的培养，对于操作人员来说具备一定的危险性，近年来针对霍乱及霍乱毒素的PCR反应快速检测技术开始出现。对于PCR检测来说，引物的选择至关重要，直接影响检测的特异性。如果引物特异性不够，则可能导致检测的假阳性结果或者假阴性结果的出现。另外，对于产毒型霍乱弧菌的检测，单独检测一个基因，往往不足以判断其致病性。2003年Fukushima等利用SYBR荧光染料建立了多重荧光实时PCR检测体系(Hiroshi F，Yoshie T，Ryotaro S.Duplex real-time SYBR Green PCR assaysfor detection of 17 species of food or waterborne pathogens in stools.J.Clin.Microbiol，2003，41：5134-5146)，虽然缩短了检测时间和工作量，但是由于采用非毒素基因的单一靶位点检测，用于检测致病菌时，其检测结果存在一定的假阳性率。 

对于食品等样品中霍乱弧菌的检测是预防与监测霍乱的重要步骤。并且霍乱弧菌的检测对于患者疾病的确诊与菌株的分型也有重要意义。 

发明内容

为了更加准确地特异性检测样品O139群霍乱弧菌的存在，本发明提供 一种特异性检测样品中O139群霍乱弧菌的组合物。该组合物包括下列引物： 

上游引物：5′-TgATgTTgTgggATAAgCAATCTT-3′(序列号：1)；