[发明专利]酿酒酵母CGMCC No.2266及其在制备(S)－(－)－β－羟基苯丙酸乙酯中的应用

权利要求书

1.酿酒酵母CGMCC No.2266，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址：北京市朝阳区大屯路中科院微生物研究所，保藏编号CGMCCNo.2266，保藏日期2007年11月26日。

2.酿酒酵母CGMCC No.2266在微生物转化制备(S)-(-)-β-羟基苯丙酸乙酯中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用为：以β-羰基苯丙酸乙酯为底物，以酿酒酵母CGMCC No.2266发酵获得的发酵液再制得的固定化细胞颗粒为生物催化剂，在邻苯二甲酸二丁酯中，于25～35℃转化反应8～72小时，转化液经分离纯化得到所述(S)-(-)-β-羟基苯丙酸乙酯。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述邻苯二甲酸二丁酯中底物β-羰基苯丙酸乙酯的初始浓度为5.15～100.0mmol/L。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于：每L邻苯二甲酸二丁酯中含有的菌体干重相当于以包埋法将0.330L菌体浓度为3.0～10.0g/L的发酵液制成固定化细胞颗粒在液体培养基中增殖培养16～72小时后获得的增殖培养后的固定化细胞颗粒的菌体干重；所述发酵液中菌体浓度定义为：菌体干重与发酵液体积之比。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述固定化细胞颗粒由如下方法制备得到：将经酿酒酵母CGMCC No.2266发酵培养获得的发酵液与等体积1～5％的海藻酸钠溶液相混合，所述的发酵液菌体浓度为3.0～10.0g/L，搅拌均匀得到混合液，将混合液逐滴滴入2.5～4.0％的氯化钙溶液中，连续搅拌，含有菌体的海藻酸钠混合液固化形成凝胶珠固定化颗粒，将得到的固定化悬浮液放置于35～38℃条件下固化，得到的固定化颗粒用无菌生理盐水洗涤，获得固定化细胞颗粒，将得到的固定化颗粒分散于发酵培养基中进行增殖培养16～72h获得增殖培养后的固定化细胞颗粒，以增殖培养后的固定化细胞颗粒为生物催化剂。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述固定化细胞颗粒粒径为1～5mm。

8.如权利要求2～7之一所述的应用，其特征在于所述的应用按如下方法获得发酵液：

(1)斜面培养：将酿酒酵母CGMCC No.2266接种至斜面培养基，26～35℃培养4～6天得到斜面菌种；斜面培养基终浓度组成为：麦芽汁5～15g/L，酵母粉2～4g/L，蛋白胨4～6g/L，葡萄糖7～12g/L，琼脂15～25g/L，溶剂为水，pH自然；灭菌后冷却制成斜面；

(2)种子培养：将斜面菌种接种至种子培养基，28～32℃、150～200r/min培养18～28h，得种子液；种子培养基终浓度组成为：葡萄糖26～32g/L，酵母粉2～4g/L，硫酸铵3～6g/L，无水MgSO₄ 0.2～0.4g/L，K₂HPO₄·3H₂0 0.5～1.5g/L，KM₂PO₄ 0.6～1.5g/L，溶剂为水，pH自然，灭菌后冷却；

(3)将种子液以体积比5～20％的接种量，接种至发酵培养基，28～32℃、150～200r/min培养18～28h，得发酵液；发酵培养基终浓度组成为：葡萄糖26～32g/L，酵母粉2～4g/L，硫酸铵3～6g/L，无水MgSO₄ 0.2～0.4g/L，K₂HPO₄·3H₂0 0.5～1.5g/L，KH₂PO₄0.6～1.5g/L，溶剂为水，pH自然，灭菌后冷却。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于按如下方法获得所述的生物催化剂：将发酵液与等体积2％的海藻酸钠溶液相混合，所述的发酵液菌体浓度为4.3g/L，搅拌均匀得到混合液，将混合液逐滴滴入3.5％的氯化钙溶液中，连续搅拌，含有菌体的海藻酸钠混合液固化形成凝胶珠固定化颗粒，将得到的固定化悬浮液放置于37℃条件下固化，得到的固定化颗粒用无菌生理盐水洗涤，获得固定化细胞颗粒；得到的固定化细胞颗粒分散于发酵培养基中进行增殖培养24h，获得增殖培养后的固定化细胞颗粒，以增殖培养后的固定化细胞颗粒为生物催化剂。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于所述的应用为：以β-羰基苯丙酸乙酯为底物，以增殖培养后的固定化细胞颗粒为生物催化剂，在邻苯二甲酸二丁酯中，于30℃、180r/min条件下转化反应72小时，转化液过滤，取滤液脱去溶剂邻苯二甲酸二丁酯，再经硅胶柱层析分离，得到所述(S)-(-)-β-羟基苯丙酸乙酯；邻苯二甲酸二丁酯中，底物β-羰基苯丙酸乙酯初始浓度为5.15～100mmol/L，每L邻苯二甲酸二丁酯中含有的菌体干重相当于以包埋法将0.330L菌体浓度为4.3g/L的发酵液制成固定化颗粒在发酵培养基中增殖培养24小时后获得的增殖培养后的固定化细胞颗粒的菌体干重。