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[发明专利]一种体外合成mRNA质粒模板的改造方法-CN201910443940.0在审
发明人：王小莉;李东升 -专利权人：湖北爱济莱斯生物科技有限公司
申请日： 2019-05-27 - 公布日： 2019-09-13 - 主分类号： C12N15/66 文献下载
摘要：本发明公开了一种体外合成mRNA质粒模板的改造方法，包括如下步骤：(1以eGFP mRNA质粒为模板质粒，设计突变引物；(2)将PCR相关试剂、模板质粒、突变引物在冰上解冻并吹打混匀，进行PCR反应液的配制将上述酶切体系于37℃条件下消化1h；(4)取上述Dpn I消化产物5μL加入解冻的感受态细胞中，转化涂板；(5)待菌落长出后，筛选突变的阳性克隆，获得了含有BamHI和XhoI酶切位点的体外合成mRNA的质粒模板通过点突变的方法对原构建的体外合成mRNA质粒模板进行了改进，引入了酶切位点从而大大简化了制备不同种体外合成mRNA质粒模板的步骤。
质粒模板种体模板质粒体外合成合成吹打混匀解冻突变设计突变引物限制性内切酶感受态细胞酶切体系酶切位点突变引物消化产物阳性克隆通过点菌落构建涂板位点质粒制备配制改造筛选消化引入转化改进

[发明专利]一种利用PCR技术快速获得大量质粒DNA的方法-CN201410560288.8在审
发明人：丁锐;张立军;陈旭辉;崔振海;敖永华;于金龙;马蓉;曹松屹;秦萍 -专利权人：沈阳农业大学
申请日： 2014-10-21 - 公布日： 2015-03-04 - 主分类号： C12N15/10 文献下载
摘要：本发明涉及一种利用PCR技术快速获得大量质粒DNA的方法，属于分子生物学技术领域。本发明根据需要获得的模板质粒DNA序列信息设计引物，上下游引物分别与质粒DNA的两条模板链互补并且两条引物的5’端20个碱基互补。利用这两条引物对0.5μg模板质粒进行PCR扩增，可在体外快速获得大量质粒DNA。与传统质粒获取方法相比，本发明不依赖宿主菌，应用范围广；跳过了质粒转化、菌体培养、质粒提取等步骤，既节省了时间又节约了成本。
一种利用 pcr 技术快速获得大量质粒 dna 方法

[发明专利]快速构建多聚腺苷酸polyA质粒的方法及相应质粒-CN202310974073.X在审
发明人：钱莉春;姜伟;赵碧玉;吴昕;杨熹;黎建军;李定华 -专利权人：苏州左旋星生物科技有限公司
申请日： 2023-08-04 - 公布日： 2023-09-08 - 主分类号： C12N15/66 文献下载
摘要：本发明涉及快速构建多聚腺苷酸polyA质粒的方法及相应质粒。该方法包括构建质粒骨架pLevoB1，合成目的mRNA基因片段并添加酶切位点，将目的mRNA基因片段插入质粒骨架pLevoB1中，即得到多聚腺苷酸polyA质粒成品，用作目标mRNA的模板质粒DNA。本发明能稳定、高效地为目的mRNA基因片段添加多聚腺苷酸polyA序列，且提高了正确克隆比例，所得多聚腺苷酸polyA质粒成品可用作目标mRNA的模板质粒DNA；还能便捷地更换线性化位点或增加多聚腺苷酸
快速构建腺苷酸 polya 质粒方法相应

[发明专利]一种筛选公共引物的方法-CN201410556794.X有效
发明人：孙万平;段欠欠;王萃;胡颖熹;沈苏南;朱雪明 -专利权人：苏州大学
申请日： 2014-10-20 - 公布日： 2015-01-21 - 主分类号： C12Q1/68 文献下载
摘要：本发明公开了一种筛选公共引物的方法，具体为选择待扩增靶序列作为模板，设计一对特异引物与m条正向公共引物、n条反向公共引物，在特异引物的5'端分别连接公共引物、酶切位点和保护碱基组合成“长引物”，然后用“长引物”对模板进行PCR扩增，得到与公共引物序列同源的PCR产物，将这段模板序列导入质粒载体，通过转化将质粒转移进入大肠杆菌感受态细胞，获得公共引物的质粒模板；利用此质粒模板，通过排列组合可实现m×n对公共引物的敏感性筛选
一种筛选公共引物方法

[发明专利]一种RNA片段及其制备方法和用途-CN201310263324.X有效
发明人：彭长庚;温婷 -专利权人：昆山彭济凯丰生物科技有限公司
申请日： 2013-06-27 - 公布日： 2017-05-03 - 主分类号： C12N15/10 文献下载
摘要：本发明公开了一种制备RNA片段的方法，该方法包括（1）获得化学合成的双链DNA；（2）将所述化学合成的双链DNA片段克隆至载体中以得到多个克隆的扩增质粒，并分别对多个克隆的扩增质粒进行DNA测序；挑选能够完全正确编码目的RNA片段的扩增质粒的克隆作为模板质粒；（3）对模板质粒进行酶切，得到酶切产物，并从酶切产物中分离能够完全正确编码目的RNA片段的转录模板片段；（4）对所述转录模板片段进行体外转录，得到转录产物。
一种 rna 片段及其制备方法用途

[发明专利]一种生产FecB基因g.A746G定点突变绵羊的试剂盒及其方法-CN202111586529.2在审
发明人：王小龙;周世卫;陈玉林;高亚伟;王倩;蔡蓓 -专利权人：西北农林科技大学
申请日： 2021-12-21 - 公布日： 2022-04-01 - 主分类号： C12N15/12 文献下载
摘要：所述的试剂盒中含有FecB‑pegRNA的体外转录模板质粒、FecB‑sgRNA的体外转录模板质粒以及PE2mRNA的体外转录模板质粒，以FecB‑pegRNA的体外转录模板质粒、FecB‑sgRNA的体外转录模板质粒为模板经PCR扩增得到的FecB‑pegRNA体外转录模板序列如SEQ ID No.4所示，FecB‑sgRNA体外转录模板序列如SEQ ID No.5所示。
一种生产 fecb 基因 a746g 定点突变绵羊试剂盒及其方法

[发明专利]靶向整合外源DNA序列到大鼠和小鼠Rosa26位点的方法及其应用-CN201310455151.1有效
发明人：杨兴林;陈国泽;彭娟;潘讴东;王富杰;夏清梅;殷珊 -专利权人：和元生物技术(上海)有限公司
申请日： 2013-09-29 - 公布日： 2014-01-29 - 主分类号： C12N15/11 文献下载
摘要：本发明公开了一种靶向整合外源DNA序列到大鼠和小鼠Rosa26位点的方法及其应用，本发明通过构建的TALEN质粒、小鼠同源重组模板质粒和大鼠同源重组模板质粒，并将该相应的质粒分别转入小鼠或大鼠细胞中，能获得的稳定细胞株
靶向整合 dna 序列大鼠小鼠 rosa26 方法及其应用

[发明专利]一种基于ROSA26位点构建外源DNA修复模板的方法-CN202310261805.0在审
发明人：陈亚檞;杨宇;张双;邹家伦;袭昊瞳;朱茂碧;范江霖 -专利权人：五邑大学
申请日： 2023-03-17 - 公布日： 2023-07-11 - 主分类号： C12N15/63 文献下载
摘要：本发明涉及核酸分子技术领域，具体公开了一种基于ROSA26位点构建外源DNA修复模板的方法，包括以下步骤：构建重组质粒；将酶切线性化的重组质粒和酶切后的外源基因序列连接，构成中间体质粒，所述中间体质粒含有启动子、外源基因序列和PloyA；将穿梭质粒、中间体质粒、与ROSA位点相关的上、下游同源臂片段通过无缝克隆连接，获得外源DNA修复模板。本发明将含有启动子、外源基因序列和PloyA的中间体质粒、与ROSA位点相关的上、下游同源臂片段通过无缝克隆连接并入载体中，构建出重组质粒，本发明提供的方法提高了构建准确率并完成测序验证无误。
一种基于 rosa26 构建 dna 修复模板方法

[发明专利]基于mariner转座子构建自杀型质粒及耐药突变菌株的方法-CN201910282837.2有效
发明人：孙坚;李龚;何玉张;刁晓苑;于泳鑫;刘雅红;廖晓萍 -专利权人：华南农业大学
申请日： 2019-04-10 - 公布日： 2020-07-31 - 主分类号： C12N15/63 文献下载
摘要：本发明共公开了一种基于mariner转座子构建自杀型质粒及耐药突变菌株的方法。该自杀型质粒的构建包括如下步骤：以pCat‑marinerr质粒为模板进行PCR扩增，将获得的扩增产物作为质粒骨架；然后以pUC57‑tpm质粒为模板扩增tpm抗性基因，再将质粒骨架和tpm抗性基因进行同源重组，得到所述自杀型质粒。本发明中的耐药突变菌株是将自杀型质粒转化大肠杆菌WM3064感受态细胞，然后将获得菌株和目标菌株混合培养，再用含有亚碲酸盐的单药板、以及含有亚碲酸盐和原抗性筛选标记药物的双药板进行筛选，得到耐药突变菌株
基于 mariner 座子构建自杀质粒耐药突变菌株方法

[发明专利]一种基因定点多位点突变的方法-CN200910105658.8有效
发明人：田静;董升;刘琼 -专利权人：深圳大学
申请日： 2009-02-27 - 公布日： 2009-11-18 - 主分类号： C12N15/09 文献下载
摘要：根据突变的碱基所处序列的位点分别设计正向突变引物和反向突变引物，突变位点位于正向引物的中间位置、反向引物靠近5’端的位置；再根据突变的位点数设计出与位点数相同对数的突变引物；由第一对引物以含有甲基化位点的质粒为模版，以高保真酶进行第一轮PCR反应，扩增出含第一突变碱基的基因片段；采用DpnI酶将基因片段进行酶切，去除模板质粒，得到具有一个目标突变位点、有开口的环状质粒；再以环状质粒为模板，依次加入剩余的突变引物进行PCR反应，得到具有多个突变位点、有开口的环状质粒。本发明利用引物互补区对有开口的环状质粒模板完成聚合酶链式反应，从而引入多于一个位点的定点突变。
一种基因定点多位点突变方法

[发明专利]一种靶向敲除HBx蛋白的质粒及其构建方法和应用-CN202110506989.3在审
发明人：周俊;王腊;孙丹丹;邓洋;丁士杰 -专利权人：武汉科技大学
申请日： 2021-05-10 - 公布日： 2021-08-24 - 主分类号： C12N15/85 文献下载
摘要：本发明提出了一种靶向敲除HBx蛋白的pCMVHBV‑HBx(‑)质粒以及质粒的构建方法，构建方法步骤以下：以pCMVHBV质粒为模板，设计HBx的CDS突变型引物进行PCR扩增，扩增产物经凝胶回收，孵育，大肠杆菌转化，测序验证得到pCMVHBV‑HBx(‑)质粒。本发明的pCMVHBV‑HBx(‑)质粒可以靶向敲除HBx蛋白，显著抑制pgRNA和cccDNA的形成。
一种靶向 hbx 蛋白质粒及其构建方法应用

[发明专利]实时定量PCR检测花生金属硫蛋白mRNA表达水平的方法-CN201010173137.9无效
发明人：单世华;万书波;杨志艺;李春娟;闫彩霞;张廷婷 -专利权人：山东省花生研究所
申请日： 2010-05-05 - 公布日： 2010-09-01 - 主分类号： C12Q1/68 文献下载
摘要：一种实时定量PCR检测花生金属硫蛋白mRNA表达水平的方法，其包括如下步骤：1)通过将从花生组织中获得金属硫蛋白基因与载体连接，构建重组质粒，作为实时定量PCR的标准品；2)提取含有目的基因的重组质粒，计算出分子拷贝数，将重组质粒稀释成不同倍数，即为实时定量PCR反应的标准品模板；及3)提取所需组织的总RNA，反转录成cDNA作为实时定量PCR模板，进行实时定量PCR，得出起始模板的拷贝数，对其mRNA
实时定量 pcr 检测花生金属蛋白 mrna 表达水平方法

[发明专利]一种幽门螺杆菌基因无痕敲除的方法-CN201610458378.5在审
发明人：季晓飞;赵慧琳;李波清;张莹;王颖 -专利权人：滨州医学院
申请日： 2016-06-23 - 公布日： 2016-11-09 - 主分类号： C12N15/74 文献下载
摘要：本发明涉及微生物基因工程领域中的基因敲除技术，特别涉及一种幽门螺杆菌基因无痕敲除的方法，（a）构建适用于幽门螺杆菌的敲除模板质粒和辅助质粒；（b）设计目的基因同源重组双交换同源臂，在敲除模板质粒基础上构建目的基因敲除质粒，转入幽门螺杆菌中得到基因敲除突变株；（c）将辅助质粒转入上步骤得到的基因敲除突变株中，去除抗性基因，得到携带辅助质粒的无痕基因敲除突变株；（d）辅助质粒通过无抗生素传代培养消除，最终获得无痕基因敲除突变株
一种幽门螺杆基因无痕敲方法

[发明专利]SIRT6 H133Y蛋白及其富集豆蔻酰化修饰肽段的方法和应用-CN202210906268.6在审
发明人：李华;李鹏;吴娜;葛均波 -专利权人：复旦大学附属中山医院
申请日： 2022-07-29 - 公布日： 2023-03-28 - 主分类号： C12N9/80 文献下载
摘要：本发明提供了一种SIRT6H133Y蛋白及其富集豆蔻酰化修饰肽段的方法和应用，蛋白制备方法包括：以SIRT6‑FLAG为模板得到SIRT6‑FLAG片段，以pET28a质粒为模板得到质粒片段，两片段拼接得到表达质粒pET28TEV‑SIRT6，以其为模板进行PCR定点突变技术，得到过表达质粒pET28TEV‑SIRT6H133Y，转入大肠杆菌内纯化蛋白；本发明基于SIRT6H133Y蛋白对豆蔻酰基的结合力，并通过
sirt6 h133y 蛋白及其富集豆蔻修饰方法应用

[发明专利]一种用于检测酶加dA尾效率的方法-CN201910041144.4在审
发明人：郑贤杰;秦雪梅;朱乐敏;曹振;宋东亮 -专利权人：上海翊圣生物科技有限公司
申请日： 2019-01-16 - 公布日： 2019-04-26 - 主分类号： C12Q1/686 文献下载
摘要：本发明提供一种用于检测酶加dA尾效率的方法，包括：步骤一、合成5’末端分别为A、T、G、C的四组引物；步骤二、采用原核生物或者真核生物的全基因组作为模板，步骤三、对模板进行引物扩增，步骤四、制备相应的质粒，步骤五、得到模板质粒，步骤六、以模板质粒为模板，分别以四组引物作为引物，采用高保真酶进行扩增；步骤七、纯化回收步骤六的产物；步骤八、以步骤七中的产物作为模板，采用待检测的各个酶分别进行加dA尾或者PCR
引物模板质粒检测酶毛细管电泳检测高保真酶全基因组引物扩增原核生物真核生物直观分析回收扩增质粒制备合成筛选检测

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