本发明通过对野生型DNase I相关位点进行突变,筛选得到了3个效果良好的突变体,其中两个为双位点突变,突变位点分别是A249T、R42H和A249T、F110V,1个为3位点突变,突变位点为A249T、R42H、F110V,其中3位点突变的DNase I突变体效果最佳,其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示,编码核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。并公开了其在高通量测序文库构建中的应用。本发明的DNase I突变体可高效稳定打断基因组DNA,其片段化产物可应用于高通量测序文库构建,相比野生型DNase I,建库测序质量更优异,GC偏好性更低。可实现低成本,高效率建库,且测序质量优异。