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[发明专利]无网格BAC文库的建立方法及该无网格BAC文库阳性克隆的筛选方法-CN201110459957.9无效
发明人：夏正俊;吴红艳;翟红 -专利权人：中国科学院东北地理与农业生态研究所
申请日： 2011-12-31 - 公布日： 2012-07-11 - 主分类号： C40B50/06 文献下载
摘要：无网格BAC文库的建立方法及该无网格BAC文库阳性克隆的筛选方法，它涉及一种简便基因文库的建立与筛选。它解决现有无网格BAC文库阳性克隆技术中DNA杂交技术程序复杂，花费时长，存在假阳性，而且难以获得单个阳性克隆的问题。文库建立：一、BAC克隆载体的制备；二、大片段DNA的制备；三、连接及转化。阳性克隆筛选：一、PCR取阳性pool进行梯度稀释；二、振荡培养；三、用菌体离心PCR，选取滴度最大的菌液进行涂板，然后挑取8～15个克隆振荡培养，进行PCR反应，将阳性克隆pool进行再次涂板，选取单个克隆进行验证，即可获得单个阳性克隆。本发明用于BAC文库的建立和阳性克隆的筛选。
网格 bac 文库建立方法阳性克隆筛选

[发明专利]一种无假阳性T载体及制备方法-CN200910103334.0无效
发明人：马跃 -专利权人：西南大学
申请日： 2009-03-06 - 公布日： 2009-08-12 - 主分类号： C12N15/63 文献下载
摘要：本发明涉及一种用于克隆PCR片段的无假阳性T载体及制备，其是一种两个3’端均具有1个突出的dT的线性化质粒载体，所述T载体供插入3’端突出一个dA的PCR片段的位点，即线性化T载体的两个末端，位于阳性克隆筛选标记基因起始密码子与其上游的核糖体结合位点之间按本发明设计构建的T载体在用于克隆PCR片段时，不会因为T载体自连导致的阳性克隆筛选标记基因移码而产生假阳性克隆。本T载体克服了现有T载体在应用中因载体自连而产生假阳性克隆的技术机制弊端。因此，从技术机制上说(即排除其它实验因素的干扰)，本发明设计的T载体应用于T-A克隆时假阳性克隆率为零。
一种阳性载体制备方法

[发明专利]筛选转基因动物细胞阳性单克隆方法-CN200410092831.2无效
发明人：王亮;朱海;吕自力;刘婷婷;帅志强;彭涛 -专利权人：新疆金牛生物股份有限公司
申请日： 2004-11-12 - 公布日： 2005-05-18 - 主分类号： C12N5/10 文献下载
摘要：一种筛选转基因动物细胞阳性单克隆方法，其按下述步骤进行：第一步，对需要转基因的动物细胞进行培养，并进行基因转染；第二步，用能致死非基因转染动物细胞的浓度的新霉素进行筛选；第三步，转基因动物细胞阳性克隆的培养扩增；第四步，刮除非基因转染动物细胞，保留转基因动物细胞阳性克隆；第五步，挑选转基因动物细胞阳性单克隆并培养扩增，致死残留的非基因转染动物细胞；第六步，进一步培养扩增得到大量的转基因动物阳性单克隆细胞。本发明的特点：省时省工，效率高，并且大大降低了筛选转基因动物细胞阳性单克隆的成本。同时该方法适用于商业上具有经济价值的转基因动物细胞阳性单克隆的筛选，是制作转基因动物的必要手段之一。
筛选转基因动物细胞阳性单克隆方法

[发明专利]特异性抗rHAP单克隆抗体及其制备方法和试剂盒-CN201310739604.3有效
发明人：韦利军;薛宇醒;吴海燕;庄丽敏 -专利权人：常州千红生化制药股份有限公司
申请日： 2013-12-27 - 公布日： 2014-04-02 - 主分类号： G01N33/577 文献下载
摘要：本发明公开了一种特异性抗rHAP单克隆抗体及其制备方法和试剂盒，该特异性抗rHAP单克隆抗体的制备方法具有以下步骤：①免疫；②细胞融合；③阳性克隆的筛选，选择阳性细胞孔进行细胞克隆，得到抗rHAP单克隆抗体杂交瘤细胞株；④对步骤③得到的抗rHAP单克隆抗体杂交瘤细胞株进行特异性阳性克隆的筛选，选择阳性细胞孔进行细胞克隆，得到特异性抗rHAP单克隆抗体杂交瘤细胞株。⑤用步骤④得到的特异性抗rHAP单克隆抗体杂交瘤细胞株制备特异性抗rHAP单克隆抗体。本发明的特异性抗rHAP单克隆抗体用于制备体内药物浓度检测试剂盒，进而可以检测出rHAP在动物体内的分布情况，增强了检验的特异性和结果的准确性。
特异性 rhap 单克隆抗体及其制备方法试剂盒

[发明专利]一种单克隆抗体制备方法及其应用-CN200810207890.8无效
发明人：穆海东;汪宁梅;穆宇豪;刘纲;李湖丹 -专利权人：上海裕隆生物科技有限公司
申请日： 2008-12-26 - 公布日： 2010-06-30 - 主分类号： G01N33/577 文献下载
摘要：本发明公开了一种针对筛选克隆化步骤进行改进的新的单克隆抗体制备方法。使用该方法由于在ELISA筛选阳性克隆株的包被过程中，除了一般用预定抗原进行ELISA筛选阳性克隆株的步骤外，加入了与包被抗原有相近抗体结合位点的多个抗原进行ELISA筛选的步骤，排除了特异性不高的阳性克隆株；从而使最终得到的单克隆抗体特异性增强，大大减少制备抗体在使用过程中出现的交叉反应。本发明还公开了利用该方法进行cTnI的制备，包括用含有Myo、FABP、CK-MB、CRP、NTB五种抗原的混合蛋白溶液进行阳性克隆株的筛选。
一种单克隆抗体制备方法及其应用

[发明专利]周期型马来丝虫复合多价蛋白疫苗的制备方法-CN201410064467.2在审
发明人：方政;王慧;方浩;陆施娟;徐倩;胡迎青;童海燕;徐邦生 -专利权人：南通大学
申请日： 2014-02-25 - 公布日： 2014-06-04 - 主分类号： C12N15/85 文献下载
摘要：本发明公开了一种周期型马来丝虫复合多价蛋白疫苗的制备方法，包括周期型马来丝虫pcDNA3.1（+）-BmCPI/BmGAPDH重组质粒的抽提、基因转染、阳性克隆的筛选、阳性克隆的提取和扩大培养、阳性克隆的冻存、检测阳性克隆，抽提细胞总RNA，分子水平检测重组质粒在细胞中的表达、蛋白水平检测重组质粒在细胞中的表达、表达产物进行SDS-PAGE分析、周期性马来丝虫重组蛋白的提取和纯化等步骤。
周期马来丝虫复合蛋白疫苗制备方法

[发明专利]一种基于膜体系-酵母双杂交发现膜蛋白的方法-CN202111349955.4在审
发明人：朱也 -专利权人：南京瑞源生物技术有限公司
申请日： 2021-11-15 - 公布日： 2022-03-22 - 主分类号： C12N15/81 文献下载
摘要：本发明涉及膜蛋白实验技术领域，且公开了一种基于膜体系‑酵母双杂交发现膜蛋白的方法，一种基于膜体系‑酵母双杂交发现膜蛋白的方法，包括以下材料诱饵克隆：pBT3‑STE‑A、诱饵载体：pBT3‑STE、文库酵母质粒该基于膜体系‑酵母双杂交发现膜蛋白的方法，通过将诱饵质粒转化受体菌NMY51中及其自激活检测、文库筛选、筛库结果、酵母阳性克隆鉴定及测序比对与测序比对结果、酵母阳性克隆鉴定及测序比对与测序比对结果、酵母阳性克隆回转验证等步骤，通过酵母阳性克隆回转验证将筛选得到的34个酵母阳性克隆，均能在SD‑TL、SD‑TLH+30mM 3AT、SD‑TLHA+30mM 3AT缺陷性平板上生长，从而得到最终的膜蛋白，解决了与pBT3‑STE‑A
一种基于体系酵母双杂交发现膜蛋白方法

[发明专利]一种特异性识别内源标记物Brdu的单克隆抗体的筛选方法-CN201910872680.9在审
发明人：郑沣;孙小函;侯圆圆;刘姗姗;杨颂;黄强;张高英 -专利权人：武汉赛维尔生物科技有限公司
申请日： 2019-09-16 - 公布日： 2019-12-20 - 主分类号： C07K16/18 文献下载
摘要：本发明公开了一种特异性识别内源标记物Brdu的单克隆抗体的筛选方法，包括如下步骤：制作Brdu内源标记的动物模型，以及制作Brdu内源标记的细胞模型，用内源标记的动物模型及细胞模型对单抗制备中的ELISA阳性融合孔进行筛选，融合后去掉不能识别内源性Brdu标记的ELISA阳性孔，保留能识别内源标记的ELISA阳性融合孔，进行亚克隆操作，分离单克隆，对单克隆孔同法进行内源Brdu标记筛选，获得特异性单克隆细胞株
内源动物模型细胞模型筛选融合单克隆细胞株单克隆抗体种特异性标记物内源性亚克隆单抗制备制作保留

[发明专利]一种病毒穿梭质粒及其用途-CN202210412998.0在审
发明人：何霆;鲁薪安;刘光华;谢城源;修憬瀛 -专利权人：北京艺妙神州医药科技有限公司
申请日： 2022-04-20 - 公布日： 2022-07-29 - 主分类号： C12N15/867 文献下载
摘要：该病毒穿梭质粒能够用作病毒穿梭质粒通用型骨架使用，能有效地提高阳性克隆率，使筛选阳性克隆不需要特殊试剂，操作简单，节省大量时间和阳性克隆筛选成本，并且降低了产生假阳性或者假阴性结果的概率。
一种病毒穿梭质粒及其用途

[发明专利]一种用于λ-Red重组系统基因敲除重组阳性克隆检测的引物及检测方法-CN201910551942.1有效
发明人：王松太;江楠 -专利权人：武汉生物工程学院
申请日： 2019-06-25 - 公布日： 2022-12-27 - 主分类号： C12Q1/6858 文献下载
摘要：本发明公开了一种用于λ‑Red重组系统基因敲除重组阳性克隆检测的引物及检测方法。属于生物技术工程领域。本发明提供一种通用检测引物，其设计方法为在四环素tetRA基因中间约1/3处设计一对互补的引物，与原有的检测重组阳性的鉴定引物进行组合使用，分别用于检测以四环素基因tetRA为替换基因的λ‑Red重组系统基因敲除重组阳性克隆的3’端序列和5’端序列。这样设计检测引物使检测重组阳性克隆有了3种选择，可以完全避免因为待敲除的序列与四环素tetRA基因相差较小而带来的难以判断阳性结果难题。而且用通用引物检测重组阳性克隆，可以更有效的证明四环素tetRA基因插入位置的正确性。
一种用于 red 重组系统基因阳性克隆检测引物方法

[发明专利]一种多功能克隆载体及其使用方法-CN201310102710.0有效
发明人：张茂雷;何东海;郝晓燕;康涛 -专利权人：广州赛哲生物科技有限公司
申请日： 2013-03-27 - 公布日： 2014-04-30 - 主分类号： C12N15/70 文献下载
摘要：本发明公开了一种多功能克隆载体，其构建方法是利用一种抗性基因表达自救方式直接用常规抗生素筛选阳性克隆子，包括以下步骤：首先设计一对具有5’端磷酸化引物序列，接着以PUC19质粒为模版，使用高保真酶PCR使用本方法为得到的载体可以高效克隆各种PCR产物，对平末端PCR产物及普通Taq酶扩增产物也有高效克隆效率，可以完全替代平末端克隆载体和TA克隆T载体。使用该方法制备多功能克隆载体，一般阳性率大于90%，有假阳性率低，实验成本低，实验操作环节少，方便快捷的优点。本发明还公开了此种多功能克隆载体的使用方法。
一种多功能克隆载体及其使用方法

[发明专利]一种提高牦牛克隆胚胎发育率的载体、细胞和方法-CN202111581923.7有效
发明人：苏建民;余彤;张成图;吴英;孟茹;陈永忠 -专利权人：西北农林科技大学;西宁市动物疫病预防控制中心（挂西宁市畜牧兽医站牌子）
申请日： 2021-12-22 - 公布日： 2023-02-03 - 主分类号： C12N15/85 文献下载
摘要：本发明公开了一种提高牦牛克隆胚胎发育率的载体、细胞和方法，属于牦牛克隆胚胎技术领域。通过该载体转染牦牛体细胞，获得阳性单克隆；利用阳性单克隆作为供体，进行核移植，构建克隆胚，可纠正牦牛克隆胚胎异常重编程，显著提高牦牛克隆胚胎体外发育率，为阐明牦牛克隆胚胎重编程机理提供材料基础及理论依据
一种提高牦牛克隆胚胎发育载体细胞方法

[发明专利]制备木薯钙调蛋白单克隆抗体的方法及该方法制备的抗体-CN201611003904.5有效
发明人：欧文军;余厚美;安飞飞;罗秀芹;秦于玲;陈松笔 -专利权人：中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所
申请日： 2016-11-15 - 公布日： 2019-01-22 - 主分类号： C07K16/16 文献下载
摘要：本发明提供一种制备木薯钙调蛋白单克隆抗体的方法及该方法制备的抗体，所述方法包括以下步骤：用纯化的融合蛋白ACP‑CaM与佐剂免疫小鼠；用生理盐水稀释的融合蛋白ACP‑CaM腹腔冲击小鼠；取所述小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合；融合后采用HAT培养液培养和间接ELISA检测筛选，获得阳性杂交瘤细胞；用有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行克隆化直至出现阳性单克隆率为100％；排除抗体与标签蛋白ACP有交叉反应的阳性杂交瘤细胞；采用小鼠体内诱生腹水法制备钙调蛋白单克隆抗体；纯化所述钙调蛋白单克隆抗体。通过本发明方法制备的钙调蛋白单克隆抗体具有高效价、高稳定性和高特异性。
单克隆抗体钙调蛋白制备小鼠阳性杂交瘤细胞抗体融合蛋白木薯骨髓瘤细胞融合间接ELISA检测生理盐水稀释阳性单克隆标签蛋白高稳定性交叉反应佐剂免疫高效价脾细胞稀释法腹水腹腔克隆体内筛选融合

[发明专利]一种提高牛类胚胎干细胞形成效率及阳性克隆比例的方法-CN201710412108.5在审
发明人：赵学明;朱化彬;崔莉莎 -专利权人：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
申请日： 2017-06-02 - 公布日： 2017-10-03 - 主分类号： C12N5/0735 文献下载
摘要：本发明提供一种提高牛类胚胎干细胞形成效率及阳性克隆比例的方法，其是在牛体外受精胚胎培养液、干细胞培养液中添加10‑11～10‑7M(优选10‑9M)的褪黑素。该方法能够显著提高牛类ESCs克隆生成效率及第10代类ESCs克隆碱性磷酸酶(AP)染色阳性率和表面标记(OCT4和NANOG、SOX2)阳性率，并能够降低第10代类ESCs克隆中OCT4、NANOG、采用本发明方法可以有效提高牛类ESCs的形成效率及阳性克隆水平。本方法操作简单、成本低，将在牛ESCs研究领域发挥重要作用。
一种提高胚胎干细胞形成效率阳性克隆比例方法

[发明专利]p16蛋白单克隆抗体的制备方法、免疫试纸条、试剂盒及其应用-CN202211515626.7在审
发明人：杨眉;蒋春樊;邢辉;李琳;武峰 -专利权人：襄阳市中心医院
申请日： 2022-11-29 - 公布日： 2023-05-05 - 主分类号： C07K16/18 文献下载
摘要：本发明公开一种p16蛋白单克隆抗体的制备方法、免疫试纸条、试剂盒及其应用，p16蛋白单克隆抗体的制备方法包括以下步骤：将p16蛋白抗原免疫动物，并收集免疫效价合格动物的新鲜脾脏和骨髓，以提取总RNA；将所述总RNA进行反转录，PCR扩增抗体重链和轻链的可变区基因；将所述抗体重链和轻链的可变区基因拼接后，连入噬菌粒载体并电转化，复苏扩增获得抗体库；从所述抗体库中筛选出单克隆阳性噬菌体，并采用双抗夹心法从所述单克隆阳性噬菌体中筛选出可以配对的单克隆阳性噬菌体；对可以配对的单克隆阳性噬菌体进行二次特异性功能检测，并测序获得抗体序列，即为p16蛋白单克隆抗体。制得的p16蛋白单克隆抗体特异性和灵敏度高。
p16 蛋白单克隆抗体制备方法免疫试纸试剂盒及其应用

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