[发明专利]一种水稻复杂性状基因定位的方法

摘要

本发明涉及植物基因定位技术领域，特别涉及一种水稻复杂性状基因定位的方法，本申请采用目标性状差异显著的两个水稻亲本，构建F₂群体，根据表型将F₂群体分成≥3个亚群，并在每个亚群中选取表型一致的≥30个单株，提取DNA构建多个混池进行重测序，通过将每个混池的测序reads与参考基因组序列比对，利用软件GATK检测SNP，采用SNP‑index方法计算对应位点的SNP‑index和ΔSNP‑index值，绘制出ΔSNP‑index的分布图，将显著关联ΔSNP‑index对应区域为候选区域，取相同物理位置上不同ΔSNP‑index的交集对应的区域为最终候选区域，再根据基因注释网站、测序深度和ΔSNP‑index值预测出候选基因。该方法成本低、耗时短、效率高，能定位出多个候选基因，能快速缩小目标基因所在的候选区域，能准确预测出紧密连锁的目标基因数目。

主权项

1.一种水稻复杂性状基因定位的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)群体构建：选取目标性状差异显著的两个水稻亲本，亲本经杂交获得F₁代，F₁代自交获得F₂代分离群体；(2)表型鉴定与分群：对步骤(1)的两个亲本和F₂代分离群体中各个单株进行表型鉴定，并根据表型性状将F₂代分离群体分为4个亚群：完全黑色、部分黑色、棕色和白色；(3)构建多个混池：在步骤(2)分群的每个亚群中挑选出≥30个单株，每个亚群的单株取新鲜叶片，并采用CTAB法提取每个单株DNA，将各单株DNA等量混合，组成多个DNA混池；(4)测序：检测步骤(3)中的两个亲本和每个亚群混池的DNA质量，样品DNA合格后用于构建测序文库，文库质量检测合格后，进行基因组重测序；(5)数据比对与SNP检测：将步骤(4)获得的reads重新定位到水稻参考基因组后，通过BWA软件，将获得的reads比对到参考基因组进行比对，统计参考基因组上碱基的覆盖情况，通过GATK软件检测SNPs；(6)SNP‑index分析：首先，将步骤(5)的SNPs中有多个基因型的SNPs、reads支持度小于4的SNPs位点、混池间基因型一致的SNPs位点以及隐性混池基因不是来自于隐性亲本的SNPs位点依次过滤掉；然后，利用两亲本的SNPs数据，分别计算出各混池的SNP‑index，对各个混池的SNP‑index进行两两比较并计算出Δ(SNP‑index)，并采用Distance方法对Δ(SNP‑index)进行拟合，最后分别绘制出各个混池的SNP‑index以及Δ(SNP‑index)在染色体上的分布图；所述各混池SNP‑index采用两两比较的方法，计算公式为：其中n代表所有混池的数量，m代表任意两个混池且m＝2；(7)候选基因分析：选取在95％或99％置信区间对应的阈值以上的基因组区域作为目标基因的候选区域，目标基因的候选区域在不同Δ(SNP‑index)的结果中出现相同的候选区域时，选取这些区域的交集作为最终的候选区域；再利用水稻基因组注释网站对候选区域内的基因进行注释，预测功能与花青素相关的基因作为候选基因；候选区域包含或邻近水稻花青素合成相关的已知基因作为候选基因；选取测序深度不低于4×，且Δ(SNP‑index)≥0.67所在的基因为候选基因。