[发明专利]南蛇藤提取物含药血清对HBV和MIF作用的研究方法

摘要

本发明涉及一种南蛇藤提取物含药血清对HBV和MIF作用的研究方法。该南蛇藤提取物含药血清对HBV和MIF作用的研究方法按顺序包括：南蛇藤提取物含药血清的制备过程，人骨髓间充质干细胞分离、培养、纯化过程，乙肝病毒体外自然感染人骨髓间充质干细胞的过程，南蛇藤提取物含药血清处理感染了HBV的人骨髓间充质干细胞的过程，结果检测过程，统计学分析过程。本发明明确南蛇藤素对人类乙型肝炎的药用价值，为突破乙型肝炎奠定基础。明确给药后人BMSCs中HBsAg、HBeAg、HBcAg、MIF的量的变化趋势、HBVcccDNA的表达水平及MIF基因表达情况，为下一步探究南蛇藤素的作用机制提供数据支持。

主权项

1. 南蛇藤提取物含药血清对HBV和MIF作用的研究方法，其特征在于，该南蛇藤提取物含药血清对HBV和MIF作用的研究方法按顺序包括：南蛇藤提取物含药血清的制备过程，人骨髓间充质干细胞分离、培养、纯化过程，乙肝病毒体外自然感染人骨髓间充质干细胞的过程，南蛇藤提取物含药血清处理感染了HBV 的人骨髓间充质干细胞的过程，结果检测过程，统计学分析过程；/n所述的南蛇藤提取物含药血清的制备过程包括以下步骤：/n步骤一，将南蛇藤茎切断、粉碎成粉，烘干15kg，用浓度95%乙醇150L提取3小时，重复3次，合并提取液，回收乙醇，浸膏900g加水分散后，石油醚萃取3 次，再用乙酸乙酯萃取3次，收集乙酸乙酯层，水洗涤3 次，减压浓缩，真空冻干，得南蛇藤茎乙酸乙酯提取物250g，贮存于4℃ ，每1g 提取物相当于60g 生药，使用前以含0.5%羧甲基纤维素钠的蒸馏水助悬，/n步骤二，取新西兰白兔16 只，随机分成药物组及溶媒对照组，灌药前禁食4h，自由饮水；药物组给予南蛇藤提取物20mg/kg·d每天分2次给药，共4天，第4天1次给药，2小时后无菌条件下心室采血， 3000/L 离心10分钟，共3 次，56℃,30 min 灭活，0.22μm 微孔滤膜过滤除菌，1.5 mL EP 管分装，于-20℃保存备用；/n所述的人骨髓间充质干细胞分离、培养、纯化的过程按顺序包括：/n人BMSCs 的分离、培养过程，人BMSCs 的换液过程，人BMSCs 的传代过程，人BMSCs 生长曲线的绘制及对数生长期倍増时间的测定过程，流式细胞术检测人BMSCs 群体含量分布过程，流式细胞术检测人BMSCs 表面标志过程，/n所述人BMSCs 的分离、培养过程包括以下步骤：/n步骤一，于髂后上嵴抽取红骨髓2mL，加入100μ/mL 肝素0.5 mL 抗凝，无菌操作台内以2-3 mL PBS 缓冲液稀释，/n步骤二， 将稀释液按1：1 比例缓慢移入装有人淋巴细胞分离液Ficoll-Paque 的离心管中，使其分层明显，2000rpm，离心20min，/n步骤三，收集位于界面层呈云雾状的有核细胞层，PBS 洗涤，1800rpm，离心15min，/n步骤四，弃上清，PBS 重复洗涤两次，/n步骤五，弃上清，用完全培养液悬浮，以1×105/cm3 的密度接种于培养瓶，置于37℃，50mL/L CO2 及饱和湿度条件下培养，标记为原代，即P0，/n步骤六，视细胞生长情况48 小时首次更换培养基，/n所述人BMSCs 的换液过程包括以下步骤：/n步骤一，培养人BMSCs 采用含10% V/V胎牛血清的LG-DMEM 完全培养基，根据细胞生长状态，每3-4 天左右更换一次培养基，/n步骤二， 换液时，先用巴斯德吸管柔和吹细胞面，把衰老的细胞吹下来，弃用旧培养基，加入3-5mL 新的培养基，置于37℃，50mL/L CO2 的培养箱中培养，/n所述人BMSCs 的传代过程，包括以下步骤：/n步骤一， 显微镜下观察人BMSCs 生长状态，当细胞长到80%-90%融合时，需要进行消化、传代，/n步骤二，轻晃培养瓶，弃去旧的细胞培养基，用5mL PBS 洗涤细胞两次，以去除血清残留，/n步骤三，每瓶加入1 mL 0.25%胰蛋白酶+0.01% EDTA 消化液，在37℃消化不超过分钟，在纤维镜下控制消化时间，细胞突起收缩变形即可终止，/n步骤四，弃上清，加入3mL 完全培养基或胎牛血清终止胰蛋白酶作用，/n步骤五， 弃上清，用PBS 清洗细胞2 遍，加入新的完全培养基，轻轻吹打细胞使细胞脱落形成单细胞悬液，/n步骤六，根据细胞数量的多少按1:3 或更高比例接种于新的培养瓶，接种密度为1.0-2.0×103/cm3,置37℃，50mL/L CO2 的培养箱中培养，/n所述人BMSCs 生长曲线的绘制及对数生长期倍増时间的测定过程，包括以下步骤：/n步骤一， 培养至第5 代的人BMSCs,进入对数生长期时，用胰蛋白酶溶液消化，制成单/n细胞悬液，细胞计数板计数，/n步骤二，将人BMSCs 以1×104/cm2 的密度接种于24 孔培养板中，使各孔中准确接种相同数量的细胞，/n步骤三，从接种后第2 天起每日的相同时点，分别计数3 个孔中的细胞总数，连续计数到第8 天，/n步骤四， 以培养时间为横轴，细胞数为纵轴绘制生长曲线，/n步骤五， Patterson 公式计算细胞在对数生长期倍增时间，即Td =Tlg2/lg(Nt/No)，Td：倍增时间，小时；T:细胞由No 增至Nt 时所用的时间，小时；N:细胞数，/n所述流式细胞术检测人BMSCs 群体含量分布过程，包括以下步骤：/n步骤一，培养至第5 代的人BMSCs 进入对数生长期时，用胰蛋白酶溶液消化，制成单细胞悬液，不少于106，/n步骤二， PBS 洗涤，800rpm，离心6min，2 次，/n步骤三， 弃上清，轻敲离心管使细胞适当分散，缓慢滴加1mL -20℃预冷的70%乙醇中，轻轻吹打混匀，4℃固定24小时，/n步骤四， 800rpm，离心6min，去除乙醇固定液，PBS 洗2 次，/n步骤五，用0.5 mL 重悬细胞并转至Tube 中轻轻吹打，防止细胞破碎，/n步骤六，加RNase-A 约3μL 至终浓度约为50μg/ mL,37℃水浴消化30min，/n步骤七， 加PI 约400μL 至终浓度约为65μg/ mL，37℃避光染色30min，/n步骤八， 用300 目，孔径40-50 微米，尼龙网过滤，上机检测，/n所述流式细胞术检测人BMSCs 表面标志过程，包括以下步骤：/n步骤一，培养至第5 代的人BMSCs，胰蛋白酶溶液消化，PBS 重悬成单细胞悬液，计数，根据需要用台盼蓝进行细胞活性检测，/n步骤二， 1000rpm,离心10min，用适量的PBS 缓冲液重悬细胞为1×106 个/mL，/n步骤三， 移入流式管，加入不同一抗，轻轻混匀，不同抗体均设对应的IgG 同型对照，/n步骤四，避光室温孵育30 分钟，/n步骤五，加入缓冲液重复洗涤2 次，重悬细胞后上流式仪检测，/n步骤六，根据同型对照的突光强度设定阴性细胞群阈值，观察每一种单抗的阳性细胞表达率及荧光强度；/n所述乙肝病毒体外自然感染人骨髓间充质干细胞的过程按顺序包括： 感染血清的准备过程， HBV 病毒感染人BMSCs的过程， HBV 感染后的人BMSCs 生长曲线的绘制及对数生长期倍増时间的测定过程， HBV 感染后的人BMSCs 细胞周期的测定过程， HBV 感染后的人BMSCs 基因组DNA 的提取过程， HBV 感染后的人BMSCs 培养上清液的收集过程， HBV感染后的人BMSCs 培养上清液中HBV DNA 的提取过程， HBV 感染后的人BMSCs 合成与分泌HBV DNA 的检测过程，地高辛，即digoxigenin，DIG，标记全长DNA探针过程，DNA 印记，即Southern blotting，检测感染HBV 后的人BMSCs 是否合成HBV cccDNA过程， 电化学发光法检测感染HBV 后的人BMSCs 培养上清中是否存在HBsAg 和HBeAg的过程，间接免疫荧光检测HBV 感染后的人BMSCs 是否表达HBcAg的过程，特异性抗体阻断实验的过程，/n所述感染血清的准备过程包括以下步骤：/n取同时满足下列三项指标的患者乙肝患者血清,采集后超净工作台内0.22 微米滤器过滤除菌，分装，-80℃储存备用；/n条件一， HBsAg(+),Anti-HBsAg(-),HBeAg(+),Anti-HBeAg(-),HBcAg-Ab-IgG(+)/n条件二， HBV DNA:5.4×108copies/mL/n条件三， 患者之前未接受抗病毒治疗，HCV(-),HIV(-)/n所述HBV 病毒感染人BMSCs的过程包括以下步骤：/n步骤一，处于对数生长期的第5 代人BMSCs，在超净工作台里吸净完全培养基，更换无血清无抗生素的LG-DMEM 培养基，37℃，50mL/CO2 条件下培养24 小时，/n步骤二，取出细胞，吸净LG-DMEM 培养基，更换含10% (V/V)的感染血清的双无，即无FCS、无抗生素，培养基在37℃，50mL/CO2 条件下孵育24 小时，/n步骤三，吸净含有病毒血清的培养基，为免除感染血清对实验结果的干扰，PBS 冲洗细胞6 次，收集最后一次洗涤液留检，用FQ-PCR、电化学发光法检测最后一次洗涤液中是否还有病毒的残留，/n步骤四，更换完全培养基，将细胞放回37℃、50mL/CO2 的培养箱中继续培养，此时开始计算为0 天，/n所述HBV 感染后的人BMSCs 基因组DNA 的提取过程包括以下步骤/n步骤一， 从感染后第1 天起，每天用胰蛋白酶溶液消化、收集人BMSCs，PBS 洗涤细胞5次，弃上清，细胞沉淀用100μL PBS 重悬，/n步骤二， 用微量样品基因组DNA 提取试剂盒，即TIANamp Micro DNA Kit，提取感染后各天的人BMSCs 的细胞基因组DNA,所有样品使用前平衡至15℃-25℃的室温下，提取过程按试剂盒说明书进行，/n所述 HBV 感染后的人BMSCs 培养上清液的收集过程包括以下步骤：/nHBV 感染人BMSCs 后，视细胞生长情况给予换液或传代处理，每天收集人BMSCs培养上清液，1000rpm，离心10min，去除沉淀，将上清分装到灭菌管EP 管中，标记后-20℃保存备用，样本注意避免反复冻融，不超过3 次，/n所述HBV 感染后的人BMSCs 培养上清液中HBV DNA 的提取过程包括以下步骤：/n培养上清液-20℃取出后融化，按照核酸扩增荧光定量检测试剂盒说明进行，/n所述 HBV 感染后的人BMSCs 合成与分泌HBV DNA 的检测过程包括以下步骤：/n荧光定量PCR检测感染后人BMSCs 细胞内合成与分泌至培养上清中的HBV DNA 的含量，具体可按照核酸扩增荧光定量检测试剂盒说明书及Light Cycler II 型核酸扩增荧光检测仪操作流程进行检测，/n所述地高辛标记全长DNA探针过程包括以下步骤：/n制作全长的HBV DNA 探针，标记按照标记检测试剂盒说明进行，/n所述DNA印记，即Southern blotting，检测感染HBV后的人BMSCs 是否合成HBV cccDNA的过程包括以下步骤：/n收集HBV 感染后的第2、4、6、8 天的人BMSCs 基因组DNA 并纯化cccDNA，Southernblotting 检测HBV 感染后的人BMSCs 是否合成HBV cccDNA，/n所述电化学发光法检测感染HBV 后的人BMSCs 培养上清中是否存在HBsAg 和HBeAg的过程包括以下步骤：/n检测前-20℃取出待测样品于室温下融化，按Roche 公司的HBsAg、HBeAg 定量检测试剂盒说明书及Elecsys2016 全自动电化学发光免疫分析仪的操作流程进行检测，/n所述间接免疫荧光检测HBV 感染后的人BMSCs 是否表达HBcAg的过程包括以下步骤：/n从感染后第1 天起，每天收集细胞的同时留一孔细胞，用间接免疫荧法检测人BMSCs是否表达HBcAg，/n所述特异性抗体阻断实验过程包括以下步骤：/n步骤一， 将含10%的感染血清的双无培养基加入不同稀释度的抗HBsAg 的特异性抗体，37℃作用2h，/n步骤二， 接种人BMSCs，同期设细胞抗原对照组，即含10%的感染血清的双无培养基接种人BMSCs，在37℃，50mL/CO2 条件下孵育24 小时，/n步骤三，PBS 洗涤6 次，最后一次洗涤液留检，用FQ-PCR、电化学发光法检测最后一次洗涤液中是否还有病毒的残留，/n步骤四，更换完全培养基，将细胞放回37℃，50mL/CO2 的培养箱中继续培养，/n步骤五， 72h 后收集人的BMSCs 培养上清，用电化学发光法检测HBsAg，检测方法同前面，/n步骤六，计算阻断率，阻断率=(（细胞抗原对照组-细胞抗原实验组）/细胞抗原对照组)×100%；/n所述南蛇藤提取物含药血清处理感染了HBV 的人骨髓间充质干细胞的过程包括以下步骤：/n步骤一，设立低、中、高含药血清组，含药血清在培养体系中的体积比分别为10%、20%、30%，同时设阴性对照组以及5-Fu 阳性对照组， 终浓度为10 mg/L ，/n步骤二，取24 孔培养板，将对数生长期上述感染了HBV 的人BMSCs 细胞密度调整至1×104 个/孔，按需加入各组药物，每组设立6 个复孔，同时设置调零孔；/n所述结果检测的过程按顺序包括：/n检测感染HBV 后的人BMSCs 合成HBV cccDNA 的水平过程，检测感染HBV 后的人BMSCs培养上清中HBsAg、HBeAg 和HBcAg 的变化过程，检测HBV 后的人BMSCs MIF 基因表达过程，检测HBV感染后的人BMSCs MIF蛋白表达过程，/n所述检测HBV 后的人BMSCs MIF 基因表达过程包括以下步骤，步骤一，氯仿－异丙醇法抽提总mRNA，用752紫外光栅分光光度计测定样本的总RNA/n纯度及浓度后样本保存于-80℃冰箱备用，按照逆转录试剂盒说明书操作步骤，合成第1链cDNA后冻存于-20℃中备用，/n步骤二，使用SYBR Green I 荧光染料法在384 孔ABI Prism 7900 序列检测系统，即Applied Biosystems，CA，上荧光实时定量PCR 扩增，分析MIF 基因表达，为控制不同样本间的基因表达差异，用管家基因3－磷酸甘油醛脱氢酶，即glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH，作为内对照基因，来标化目的基因的表达，以GAPDH 作为内对照基因，计算MIF 基因mRNA 相对定量即2－△△CT，每个样本的MIF 基因和内对照GAPDH 基因均重复3 次，荧光实时定量PCR 扩增体系共10μL：SYBR Green IPCR Mastermix5 μL，上、下游Primer 计0.8μL，RNase-free H2O 3.2μL，cDNA 模板1μL，荧光实时定量PCR用2步法，扩增条件：95℃ 10 min，95℃ 30s、60℃ 1 min、72℃1 min、40 个循环，采用比较循环数，即cycle threshold，CT，的方法相对定量，荧光定量PCR 的结果以CT 值显示，CT值为每个反应管内的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数，△CT 值＝单样本平均目标基因CT 值-单样本平均GAPDH 基因CT 值，以2－△△CT 代表目的基因的表达水平，每个样本的△△CT＝每个样本的平均△CT -对照组的平均△CT，来计算表达差异的倍数，每次实验重复3 次，/n所述 检测HBV感染后的人BMSCs MIF蛋白表达过程，包括以下步骤：/n冰上提取组织总蛋白，用BCA法测定蛋白质含量；用5X蛋白，将总蛋白配置成含1XLB的蛋白上样液，在100℃的block 中煮沸5 min，室温下冷却后冻存于-80℃备用，配置12％的SDS-PAGE 凝胶，用湿转法将蛋白电转到PVDF/n膜上；5％脱脂奶粉常温封闭1h；加入MIF、GAPDH 一抗，即1∶2000，1：5000，/n在4℃冰箱中孵育过夜，TBST 漂洗10 min×3 次，加入二抗，即辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，室温孵育1 小时，TBST 漂洗10 min×3 次，混均ECL 显影液后在Fujilas3000显影仪中将免疫复合物显影，用计算机图像分析系统软件IMAGE J 分析测定MIF 及内参照GAPDH，比较MIF的积分光密度比值；/n所述的统计学分析过程包括以下步骤：/n应用 SPSS 17.0 软件进行统计分析，数据用（x ± s）表示，采用独立样本 t 检验比较不同处理组与对照组间的差异；采用 one-way ANOVA 方差分析方法，以不同处理方式做为组间因素，比较不同处理对 MIF 表达趋势的影响，检验水准ɑ＝0.05，双侧检验。/n