本发明提供硝化菌属细菌的检测方法及试剂盒,属于细菌检测领域,其检测试剂盒,包含序列如SEQ ID NO:1~3所示的探针1~3,其中,探针1用FAM标记,探针2用HEX标记;探针2和3同时使用;硝化菌属细菌的检测方法包括:玻片预处理;样品预处理;杂交反应和检测;其中,处理玻片用明胶粘附剂的配置方法为:将明胶溶于重蒸水中,加热搅拌,加入明矾,再依次加入芦丁和7‑羟基黄酮醇,溶解后稀释。本发明提供的试剂盒和方法可检测硝化菌属细菌,特异性强、耗时短,用于快速检测污泥中硝化细菌,为研究硝化细菌类群的空间和数量分布提供了有效的工具。