[发明专利]一种酸性蛋白酶突变体及其制备方法和应用

说明书

一种酸性蛋白酶突变体及其制备方法和应用，所述酸性蛋白酶突变体为酸性蛋白酶PepA的双位点突变体PepA‑N11R/N12S，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。所述酸性蛋白酶突变体为酸性蛋白酶PepA的复合位点突变体PepA‑N11R/N12S‑E110R，其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。

技术领域

本发明涉及基因工程、酶工程的蛋白分子改造领域，特别涉及一种经定点突变改造热稳定性提高的酸性蛋白酶突变体。

背景技术

酸性蛋白酶又称天冬氨酸蛋白酶，主要来源于曲霉、木霉等丝状真菌，是一种在酸性条件下对蛋白质具有较好水解效果的蛋白酶，其在皮革加工、食品、饲料、医学以及水产品加工等方面都具有广泛应用。

目前酸性蛋白酶的研究主要集中于黑曲霉的表达和固态发酵，这使得酸性蛋白酶的生产存在发酵周期长、质量不稳、纯化困难、劳动强度大等问题，而在其他工业真菌表达系统中的异源表达研究又相对较少。毕赤酵具有发酵成本低廉、生产杂蛋白较少等优点，是工业生产酶制剂优秀的表达系统。温度对酶促反应的作用效率具有关键作用，热稳定性的优良决定了酶对底物的催化效果的可持续性，但PepA的耐热性较差，45℃的半衰期不到30min,60℃条件下即快速失去酶活，这极大的限制了其的工业化应用，所以通过一定的手段策略提高PepA的热稳定性，是目前酸性蛋白酶产业化应用亟待解决的问题。定点突变是一种有效的蛋白分子改造，被广泛应用于酶性质的改良和酶活性的提高等方面。

发明内容

为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种酸性蛋白酶突变体及其制备方法和应用。

为达到上述目的，本发明的技术方案为：

一种经定点突变改造热稳定性提高的酸性蛋白酶突变体，所述酸性蛋白酶突变体为酸性蛋白酶PepA的双位点突变体PepA-N11R/N12S，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步的，所述酸性蛋白酶突变体为酸性蛋白酶PepA的复合位点突变体PepA-N11R/N12S-E110R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

进一步的，所述酸性蛋白酶突变体为酸性蛋白酶PepA的双位点突变体PepA-N11R/N12S的突变引物为：

PepA-N11R/N12S-F

5'-GTTACTACTCCTCAAAGATCTGACGAAGAGTACC-3'

PepA-N11R/N12S-R

5'-AGATCTTTGAGGAGTAGTAACAGCAGAACCTTTAGAAGCTGCC-3'。

进一步的，所述酸性蛋白酶突变体为酸性蛋白酶PepA的复合位点突变体PepA-N11R/N12S-E110R的突变引物为：PepA-N11R/N12S-E110R-F

5'-GTAAGATTTCAAGTAGATTTGTCCAAAACAC-3'

PepA-N11R/N12S-E110R-R

5'-TCTACTTGAAATCTTACTTGCTGCTTCAAC-3'。

进一步的，所述酸性蛋白酶突变体的最适pH为2.5，最适温度为55℃。

进一步的，所述的经定点突变改造热稳定性提高的酸性蛋白酶突变体的构造方法包括如下步骤：

(1)酸性蛋白酶基因PepA的序列优化及克隆：利用DNAwork对PepA进行毕赤酵母表达的序列优化后直接合成目的序列，以此序列为模板进行PCR扩增，将产物连接到pPIC9K载体上，得到重组载体pPIC9K-PepA；