[发明专利]基于微滴式数字PCR的TTV病毒核酸检测方法及应用

说明书

本发明属于基因工程技术领域，公开了一种基于微滴式数字PCR、对TTV病毒核酸进行检测的引物和探针组合、含有该引物和探针组合的试剂盒以及采用该引物和探针组合或试剂盒对TTV病毒核酸进行检测的方法。本发明建立在微滴式数字PCR的基础上，可以对样本中TTV病毒载量进行精确定量检测，具有较好的灵敏性，为移植后患者免疫功能评估提供了新的重要指标。与现有技术相比，本发明提供了一种覆盖度高、性能稳定、灵敏度高、操作简单、结果易判读的TTV病毒检测方法。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种基于微滴式数字PCR的TTV病毒核酸检测方法及应用。

背景技术

Torque Teno Virus(TTV)是一种无囊膜环状单链小分子DNA病毒，属于指环病毒科(Anelloviridae family)甲型细环病毒属(Alphatorquevirus genus)。TTV基因组全长约3.8kb，包括2个开放阅读框和非编码区，其编码区序列存在丰富的变异，而非编码区高度保守，与病毒复制及基因表达密切相关。TTV有多种传播途径，如血液传播，粪口，饮用水，母婴以及性传播，其传播途径的多样性也造成TTV在人群普遍存在的现状。

TTV病毒载量受人体免疫系统调控：TTV病毒大量产生并在健康人群体内维持动态平衡，通常不会引起疾病。而当人体免疫能力下降或受到抑制时，TTV病毒载量急剧增加，引发肝炎等疾病。Focosi等(2015)发现，TTV在经免疫抑制剂治疗的器官移植患者T淋巴细胞中病毒滴度明显增高。Doberer等(2019)研究发现：移植前患者外周血TTV病毒载量通常在10⁴copies/ml，随着免疫抑制治疗而逐步增加，在移植3个月后达到峰值(10⁸copies/ml)，并维持较高的病毒载量。

器官移植与造血干细胞移植后如何平衡排异与感染风险是决定患者预后的关键。器官或造血干细胞移植患者通常需要服用免疫抑制剂以防止发生排异，导致患者体内病毒载量增加从而增大感染风险。目前，临床医生主要通过测定外周血免疫抑制剂含量，判断人体免疫水平。由于个体间存在对免疫抑制剂的反应差异，因此，免疫抑制剂浓度并不能真实反映人体免疫功能强度。TTV病毒载量对抗病毒治疗不敏感，因此，可以作为人体免疫功能的标志物，进行免疫水平精准评价，制定个体诊疗方案。

数字PCR(digital PCR,dPCR)采用绝对定量的方式，直接检测目标核苷酸序列的拷贝数，检测极限可达单拷贝，具有比传统qPCR更加出色的灵敏度与精确性。微滴式数字PCR将待测样品与反应液均分到微米级的“油包水”微液滴中，体积为皮升级，数量可达十万到百万级。微液滴中只含有单分子待测样品并被油层相互隔离，形成相互独立的“微型PCR孔”，通过PCR扩增完成荧光标记和信号放大。微液滴分析仪对每个微液滴荧光信号进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，判断其含有DNA分子；没有荧光信号的微滴判读为0，判断其没有DNA分子。最终，根据泊松分布原理实现对核酸分子绝对定量。

发明内容

本发明针对临床需要快速、准确、灵敏度高的检测TTV病毒载量的需求，提供了一整套用于检测TTV病毒载量的引物、探针、试剂盒及方法。本发明依据微液式数字PCR仪，实现了TTV病毒精准定量工作。本发明的检测方法覆盖度高、性能稳定、灵敏度高、操作简单、结果易判读。

为此，本发明一方面提供了一种对TTV病毒核酸进行检测的引物和探针组合，其由序列1-3所示的引物和探针组成。

在本发明优选的实施方案中，该引物和探针组合是基于微滴式数字PCR对TTV病毒核酸进行检测。

在本发明优选的实施方案中，探针的5’端有FAM修饰，3’端有MGB修饰。

在本发明优选的实施方案中，每种引物的终浓度为300nM，探针的终浓度为100nM。

本发明另一方面提供了一种对TTV病毒核酸进行检测的试剂盒，其包含本发明所述的引物和探针组合。