[发明专利]人肝再生增强因子突变体、基因及应用

说明书

本发明公开了一种人肝再生增强因子突变体、基因及应用。人肝再生增强因子突变体，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明人肝再生增强因子突变体通过将N端7个氨基酸残基删除，然后再进行了4个单点突变(C15S、K71R、R72K、C124S)获得一种新的突变体，该突变体的基因在毕赤酵母中表达获得的突变体蛋白为单体形式存在，更有利于活性中心(C62‑C65)和结合在附近的FAD的暴露，实验结果表明其巯基氧化活性提高了20％以上，体外促肝细胞增殖能力和体内四氯化碳肝损伤的保护效果也有所提高，且潜在酶切位点突变掉后，所得产物更加均一，为后续的提取纯化的规模化可操作性提供保障，为开发临床应用提供了可靠基础。

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种人肝再生增强因子突变体、基因及应用。

背景技术

以HBV感染为代表的各种慢性肝病，难以有效彻底的治愈，导致各种肝纤维化、肝损伤、肝硬化和肝癌等，是长期以来我国人民健康的沉重负担。

多种动物来源的“促肝细胞生成素”，现在临床上仍然在使用；这类药物，纯度低，杂质多，有效成分不明，临床副反应大。寻求一种能够有效促进肝再生的药物，很有意义。

1994年，Hagiya等人(Hagiya M.et al.,1994,PNAS,91:8142-8146)首先发现了大鼠ALR(肝脏再生增强因子augmenter of liver regeneration)基因。大鼠体内的的ALR，是由两条125个氨基酸多肽链组成的同源二聚体，分子量约30KD。在埃克瘘模型中，大鼠ALR能在体内发挥显著的生物学作用，但在体外不能刺激肝源细胞的增殖。Giorda等人(GiordaR,et al,1996,Mol Med,2:97-108)于1996年克隆了人肝再生增强因子(human augmenterof liver regeneration，hALR)的基因，并发现hLAR在睾丸和肝脏中表达丰度最高。其后，大量的研究表明，体外重组表达的重组人肝脏再生增强因子(recombinant humanaugmenter of liver regeneration，简称rhALR)的生物活性研究结果表明，rhALR对大鼠实验性肝损伤与肝纤维化有明显的治疗作用。

ALR是一种进化过程中高度保守的蛋白，hALR和酿酒酵母的ERV1有46％的氨基酸序列同源性，而ERV1是一种以FAD为辅基、定位于线粒体内膜空间的氧化还原酶，与线粒体的生成、细胞分裂周期的调节有关。

hALR同样也是一种含FAD的氧化还原酶，其巯基氧化活性与肝脏再生相关。天然的hALR是同源二聚体蛋白，有两种形式：单链125个氨基酸的截短型，定位于细胞核；单链205的氨基酸的全长型，定位于线粒体和胞浆。很多研究结果表明，截短型的hALR(125aa)重组蛋白，即具有显著的促肝细胞生长和肝再生活性。

采用基因工程技术，研制重组人肝脏再生增强因子(recombinant humanaugmenter of liver regeneration，简称rhALR)，则正是一种很有希望的候选药物。

现有技术中，按表达体系分类，rhALR主要是毕赤酵母和大肠杆菌两种表达体系。但大肠杆菌表达体系由于是原核表达系统，在表达真核细胞的蛋白时，在蛋白折叠和翻译后修饰等方面存在缺陷，最终表达的rhALR活性较差。而毕赤酵母表达的rhALR产量低，且不均一，大部分蛋白发生了降解，使N端7个氨基酸残基被切掉了。

授权公告号为CN100339478C的中国发明专利公开了一种肝再生增强因子及其突变体，为同源二聚体蛋白，该蛋白的组成亚基是截短行的hALR(125aa)去除了N端前7个氨基酸残基，即剩下118个氨基酸长度。活性检测发现，该突变体与另一种只在N端7～12个氨基酸残基部分有明显差异的人ALR蛋白(GenBank XM_034465)及该人ALR蛋白第12位精氨酸缺失的突变体，三者的酵母来源产物活性无显著差异。

发明内容