[发明专利]安丝菌素的固体发酵方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物工程与技术领域的发酵方法，具体地，涉及一种安丝菌素的固体发酵方法。

背景技术

Ansamitocin(安丝菌素)是珍贵橙色束丝放线菌(Actinosynnema pretiosum)来源的美登素衍生物，其母核为19-C的大环内酰胺环，C-3连接不同长度的碳链，主要活性成份AP-3的侧链为异丁酰基，在低浓度下可抑制非白血性白血病细胞系及人类固体肿瘤。由于肠胃副效应及神经毒性，其研究还停留在临床二阶段。然而，由于安丝菌素可在临床一期中作为抗体毒素结合物及免疫结合物，各方面的研究仍在进行中。

固体发酵是接近于自然状态的一种发酵，它与液体深层发酵有许多不同，在较少的能耗和发酵时间下生产更高浓度的产物。与液体发酵比较，珍贵橙色束丝放线菌在固体发酵条件下能产生具有活性的安丝菌素苷类化合物。

珍贵橙色束丝放线菌菌丝发达，在YMG固体培养时与培养基结合紧密，无法直接测，因此无法简单直接地用单位体积表征安丝菌素的产量。同时，间接测定方法均有一定的局限性，O₂和CO₂的代谢量会随菌龄变化；测定细胞的特殊生物组分含量会因不定，并且由于菌丝生长的多态性，不同批次的菌体生长量也有很大的不同，这同菌种、培养条件和培养时间而不同，检测时间长、过程繁复影响测定的精确性；对DNA的检测则会受菌体是否产胞外脱氧核糖核酸酶限制等影响。

经对现有技术文献的检索发现，目前已报道的野生型珍贵橙色束丝放线菌产安丝菌素主要为液体发酵，一般通过多步骤工艺来回收并提纯安丝菌素。如专利号为US6573074的美国专利中描述了一种提纯安丝菌素的方法，该方法是利用甲苯或二甲苯从发酵液中粗提产物并浓缩，经石油醚沉淀后，再经过各种柱层析进一步分离纯化及结晶，以乙酸乙酯和庚烷为溶剂二次结晶后得到一定产量和纯度的安丝菌素，然而这种方法涉及多种有机溶剂和提取方法，给大规模的工业发酵带来一定的困难。同时，由于珍贵橙色束丝放线菌在液体培养过程中菌丝体成片生长，发酵中后期整个培养体系呈高度粘稠状态，大量菌丝体紧密吸附在培养容器壁，不利于传质，大大减少了产物量。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种安丝菌素的固体发酵方法。本发明中的方法是在固体发酵技术的基础上，通过在琼脂平板上铺一层可再生纤维素薄膜支持物，使得固体发酵完毕可以将菌丝体刮下，简单快速地收集菌丝体，定量单位细胞的产素量，同时通过确定最佳种子活化时间以及固体发酵的最佳接种量来提高安丝菌素的产量，本发明的方法有助于发酵过程优化调控，对工业化生产具有潜在价值。

本发明是通过以下技术方案实现的：

第一步，种子培养：将在蔗糖溶液中冷冻保存的产安丝菌素的菌体划线平板，28℃下倒置活化2-9天后转移至种子培养基中，28℃下培养该种子液；

所述培养皿直径为10cm，装液量15ml。

所述蔗糖溶液中蔗糖的质量百分比为10.3％。

第二步，固体发酵：将第一步中得到的种子液稀释至10²-10⁶CFU/ml的浓度涂布到铺有可再生纤维素薄膜支持物的发酵培养基平板上，28℃下培养7天。

所述发酵培养基为YMG培养基，其组成成分的重量百分比为：酵母提取物质0.4％、麦芽糖1％、葡萄糖0.4％、琼脂粉1.4％和蒸馏水96.8％。

所述可再生纤维素薄膜支持物的贴加方法如下：可再生纤维素薄膜剪成直径为10cm的圆形，于121℃灭菌20分钟后，50℃烘干，无菌操作条件下，用镊子夹一张纤维膜，贴入倒有培养基的固体平板，并保证纤维膜完全伸展覆盖整个平板。。

本发明利用可再生纤维素薄膜支持物进行固体发酵菌体收集，并且应用于安丝菌素的固体发酵生产过程中。同时，通过确定最佳种子活化时间以及固体发酵的最佳接种量，并且在此最佳条件下进行固体发酵。本发明的方法与和液体发酵相比：安丝菌素的产量高出2倍多，单位细胞含量高出近4倍；同时固体发酵能耗小，样品处理简单，有利于其工业化制备。

本发明中所涉及的菌株为珍贵橙色束丝放线菌(Actinosynnema pretiosumATCC 31565)。

附图说明

图1不同种子活化时间条件下固体发酵与液体发酵的安丝菌素产量对比图。

图2不同接种密度对安丝菌素产量的动态影响图。

具体实施方式