本发明公开了一种D‑转氨酶突变体及在制备L‑草铵膦中的应用,所述D‑转氨酶突变体是将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第265位色氨酸突变为丝氨酸。本发明D‑转氨酶突变体具有高对映选择性(ee99.9%),仅仅催化D‑草铵膦转化为4‑(羟基(甲基)磷酰基)‑2‑氧代丁酸,L‑草铵膦得以保留,降低了反应难度。采用一锅法,以市售的D,L‑草铵膦为底物,将无除草活力的D‑草铵膦合成L‑草铵膦,具有更高的原子利用效率,符合绿色化学的要求。操作简单,在温和的反应条件下进行,适合大规模生产,具有工业化应用的潜力,L‑草铵膦产物的产率高达100%,对映体过量(ee)大于99.9%。