本申请提供一种用于甲基化扩增子建库的组合物及应用、PCR反应液及一步法甲基化扩增子建库的方法,属于分子生物学检测技术领域。组合物包括序列分别如SEQ ID NO.1‑10所示的第一至第五引物对。本申请的组合物可在一个PCR反应体系中,通过一步PCR扩增,即实现快速且准确地对宫颈癌甲基化相关基因PAX1、JAM3以及FAM19A4的CpG岛中宫颈癌甲基化差异区域进行扩增,同时可以得到多基因多位点的甲基化水平定量结果,扩增效率高、扩增特异性强,纯化后的扩增产物可直接用于二代测序;且一步法的扩增及建库方法使不同样本间交叉污染的可能性降到最低,不仅节约时间成本,简化实验步骤,也提高了实验结果的可信度。