[发明专利]羊源多杀性巴氏杆菌荧光定量PCR标准曲线的建立

摘要

本发明公开了一种羊源多杀性巴氏杆菌荧光定量PCR标准曲线的建立，参考GenBank中公布的Pasteurella multocida基因组中toxA毒素基因，利用信息分析软件获取保守序列cstoxA，通过PCR、构建阳性标准品重组质粒pMD‑19T‑cstoxA、优化荧光定量PCR反应体系，建立羊源多杀性巴氏杆菌荧光定量PCR标准曲线，得到特异性高、重复性好、敏感性强的多杀性巴氏杆菌荧光定量PCR标准曲线，能够为菌株的定型起到方便、快捷、准确等效果，与传统实验室PCR操作相比，不仅能提高特异性又能减少实验耗材等经费开支。

主权项

1.羊源多杀性巴氏杆菌荧光定量PCR标准曲线的建立，其特征在于，包括以下步骤具体实施：步骤1，阳性标准品重组质粒pMD‑19T‑cstoxA的制备：获取保守序列cstoxA，经PCR扩增得到特异性片段，根据pMD‑19T试剂盒说明书，优化构建体系进行连接，将连接体系转化至E.coli DH5α感受态细胞中，得到阳性标准品重组质粒pMD‑19T‑cstoxA，即经蓝白斑筛选出阳性菌落并测序验证；步骤2，荧光定量PCR反应条件的优化：将步骤1中鉴定正确的重组质粒pMD‑19T‑cstoxA标准品作为模板，进行SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应，依次以最佳引物浓度、最佳引物量、最佳模板量、最佳退火温度和最佳循环次数进行反应体系的优化；步骤3，羊源多杀性巴氏杆菌荧光定量PCR标准曲线的建立：对步骤2中重组质粒pMD‑19T‑cstoxA进行浓度测定，计算重组质粒pMD‑19T‑cstoxA的拷贝数，并进行10梯度稀释，以步骤2中构建的优化方法行荧光定量PCR，每组重复3次，反应结束后，以Ct值作为纵坐标、核苷酸拷贝数为横坐标，绘制标准曲线；步骤4，通过特异性实验、敏感性实验和重复性实验验证步骤3中的标准曲线。