[发明专利]禽多杀性巴氏杆菌ptfa基因壳聚糖纳米DNA疫苗的制备方法

摘要

禽多杀性巴氏杆菌ptfa基因壳聚糖纳米DNA疫苗的制备方法，涉及疫苗的制备方法；根据禽多杀性巴氏杆菌的基因组序列设计用于扩增ptfa基因的两条引物，PCR扩增出禽多杀性巴氏杆菌ptfa基因；采用限制性核酸内切酶BamHⅠ和XholⅠ酶切禽多杀性巴氏杆菌ptfa基因和pcDNA3.1(+)质粒，然后构建禽多杀性巴氏杆菌ptfa重组质粒；然后依次加入硫酸钠、无水醋酸钠、月桂基硫酸钠、氯化钙等物质，混合均匀后即为禽多杀性巴氏杆菌ptfa基因壳聚糖纳米DNA疫苗。本发明方法制备的疫苗不含有活的病原菌，给动物应用后不会由于疫苗本身的原因而引发禽多杀性巴氏杆菌病，免疫保护率为达到85%，而且该疫苗的本质是含重组质粒的纳米颗粒，因此易于保存和运输。

主权项

禽多杀性巴氏杆菌ptfa基因壳聚糖纳米DNA疫苗的制备方法，其特征在于：具体制备方法为：步骤一、禽多杀性巴氏杆菌ptfa基因的获得(1)、根据禽多杀性巴氏杆菌的基因组序列设计用于扩增ptfa基因的两条引物PL和PU，其基因序列如序列表序列1和序列2：PU：5′‑TGCggattcATGAAAAAAGCCATTTTC‑3′PL：5′‑TGACCTCGAGtTATGCGCAAAATCCT‑3′；(2)、向PCR反应管中依次加入PU和PL引物各1微升、浓度为100‑200pmol/ml的禽多杀性巴氏杆菌基因组水溶液1微升、ddNTPs 2.5微升、Taq DNA聚合酶1微升、PCR反应缓冲液2微升和水11.5微升，混合均匀后进行PCR反应，PCR反应结束后，产物中禽多杀性巴氏杆菌ptfa基因的基因序列如序列表序列3；(3)、向上述装有禽多杀性巴氏杆菌ptfa基因的PCR反应管中依次加入限制性核酸内切酶BamHⅠ和XholⅠ各3微升、限制性核酸内切酶缓冲液4微升和水3微升，混合均匀后将PCR反应管放置于37℃的水浴锅中反应6小时，取出后再放入65℃的水浴锅中5分钟以结束反应，产物为酶切后禽多杀性巴氏杆菌ptfa基因，将其保存于‑20℃条件下，备用；     步骤二、pcDNA3.1(+)质粒的处理 向0.5毫升的离心管中依次加入pcDNA3.1(+)质粒5微升、限制性核酸内切酶BamHⅠ和XholⅠ各2.5微升、限制性核酸内切酶缓冲液2微升和水8微升，混合均匀后将离心管放置于37℃的水浴锅中反应5小时，取出后再放入65℃的水浴锅中5分钟，得到处理后的pcDNA3.1(+)质粒，备用；    步骤三、禽多杀性巴氏杆菌ptfa重组质粒的制备 (1)、依次向0.5毫升的离心管中加入处理后的pcDNA3.1(+)质粒1微升、酶切后禽多杀性巴氏杆菌ptfa基因7微升、T4 DNA连接酶1微升和T4 DNA连接酶缓冲液1微升，混合均匀后将离心管放置于16℃的水浴锅中反应8小时，取出备用；   (2)、将上述备用的0.5毫升离心管中的液体移入1.5毫升的离心管中，再加入100微升大肠杆菌JM83，混合均匀后依次放置于0℃条件下30分钟、42℃条件下1分钟和0℃条件下2分钟，然后向离心管中加入0.8毫升的大肠杆菌液体培养基，混合均匀后放置于37℃的恒温摇床中以180转/分钟的转速振荡培养1小时，培养结束后将离心管以2000转/分钟的转速离心1分钟，倒掉上清液，再向其中加入0.1毫升无菌水，将悬浮起来的沉淀吸出，并涂布于含浓度为60微克/毫升氨苄青霉素的固体培养平板上，倒置于37℃的恒温培养箱内培养12小时； (3)、挑取上述培养后的固体培养平板上的1个菌落，将菌落放入5毫升含浓度为60微克/毫升氨苄青霉素的大肠杆菌液体培养基中，置于转速为180 转/分钟，温度为37℃的恒温摇床内振荡培养12小时，备用； (4)、取上述培养后的菌液0.6毫升，向其中加入0.3毫升苯酚和0.3毫升氯仿，混合均匀后以10000转/分钟的转速离心5分钟，离心结束后吸取上层液体加入到一个2毫升的离心管中，再向其中加入1.2毫升的无水乙醇，混合均匀后以13000转/分钟的转速离心10分钟，倒掉上清液后将含有沉淀物的2毫升的离心管室温放置30分钟，向其中加入30微升无菌水溶解沉淀后备用； (5)、取上述2毫升的离心管中的液体2微升加入到0.5毫升的离心管中，再依次加入限制性核酸内切酶BamHⅠ和XholⅠ各1微升、限制性核酸内切酶缓冲液1微升和水5微升，混合均匀后放置于37℃的水浴锅中反应2小时，反应结束后琼脂糖凝胶电泳检测确定产物中的禽多杀性巴氏杆菌ptfa重组质粒，测得其浓度，并以无菌水将其调整到0.1毫克/毫升，备用； 步骤四、禽多杀性巴氏杆菌ptfa基因壳聚糖纳米DNA疫苗的制备 (1)、取浓度为0.1毫克/毫升的禽多杀性巴氏杆菌ptfa重组质粒0.5毫升加入1.5毫升的离心管中，向其中加入0.71毫克硫酸钠，待硫酸钠溶解后放置于55℃的水浴锅中保温20分钟，备用；(2)、称取无水醋酸钠4.1毫克溶解于含10毫升无菌水中的试管中，以氢氧化钠调节pH值为5.6，再向试管中加入壳聚糖0.2克，待壳聚糖溶解后将该试管置于55℃的水浴锅中保温20分钟，随后吸取试管中的0.5毫升液体加入到上述步骤（1）保温后的1.5毫升离心管中，将离心管在漩涡振荡器上振荡1分钟，然后在室温下放置1小时，备用;(3)、再依次向上述步骤（2）备用的离心管中加入3毫克月桂基硫酸钠和5毫克氯化钙，待月桂基硫酸钠和氯化钙溶解后再向其中加入0.1毫升的玉米胚芽油，混合均匀后在室温下放置20分钟，此时离心管中的液体即为禽多杀性巴氏杆菌ptfa基因壳聚糖纳米DNA疫苗。