[发明专利]发酵香肠中植物乳杆菌的快速定量检测方法

摘要

本发明提供一种发酵香肠中植物乳杆菌的快速定量检测方法，首先提取植物乳杆菌标准株的DNA，10倍梯度稀释后作为模板，用植物乳杆菌特异性引物对所得模板进行q‑PCR扩增，建立Ct值‑浓度标准曲线，其中横坐标为DNA浓度的对数，纵坐标为Ct值；然后提取发酵香肠样品中的菌株总DNA为模板，用植入物杆菌特异性引物进行q‑PCR扩增，得到待测样品中植物乳杆菌的Ct值，所得Ct值与步骤(3)的Ct值‑浓度标准曲线进行比对，得到待测样品的植物乳杆菌定量结果。本发明获得的拷贝数的结果比平板计数高约一个数量级，此外，与通过平板计数与线性方程所得活菌数的吻合度达到94％以上，说明本发明的方法可用于对植物乳杆菌的直接分析。

主权项

1.发酵香肠中植物乳杆菌的快速定量检测方法，所述方案包括以下步骤：(1)植物乳杆菌标准株的DNA提取将冻干保存的植物乳杆菌标准株接种至MRS液体培养基中，37℃下培养18h，连续活化增殖三代后，利用试剂盒进行菌株基因组DNA提取，用125μL TE buffer溶出DNA；用1％琼脂糖凝胶电泳和ND‑1000微紫外分光光度计测量所得产物的质量浓度和光密度值，并将提取的DNA保存在‑20℃下备用；(2)标准品的制作将步骤(1)得到的DNA原液的稀释至质量浓度100ng/μL得到扩增模板，用植物乳杆菌特异性引物进行PCR扩增，得到340bp目标片段；用1.0％的琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，然后在凝胶成像电泳仪的紫外灯下观察电泳结果，切取目的DNA条带，对目的DNA片段回收、纯化后，通过紫外分光光度计测量所得产物的质量浓度和OD260nm/280nm处光密度值；(3)建立Ct值‑浓度标准曲线将步骤(1)得到的DNA进行10倍梯度稀释，以所得浓度10‑1～10‑6的DNA稀释液作为模板，用植物乳杆菌特异性引物对所得模板进行q‑PCR扩增，建立Ct值‑浓度标准曲线，其中横坐标为DNA浓度的对数，纵坐标为Ct值；其中，q‑PCR的扩增程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸10min；(4)待测发酵香肠样品中菌株总DNA的提取对发酵香肠进行预处理，采用试剂盒提取待测待测发酵香肠样品中菌株的DNA，‑20℃保存；(5)待测样品中植物乳杆菌的定量分析以步骤(4)得到的DNA为样品模板，以无菌无酶水作为阴性对照模板，采用植物乳杆菌特异性引物进行q‑PCR扩增，得到待测样品中植物乳杆菌的Ct值，所得Ct值与步骤(3)的Ct值‑浓度标准曲线进行比对，得到待测样品的植物乳杆菌定量结果。