[发明专利]发酵香肠中植物乳杆菌的快速定量检测方法

说明书

本发明提供一种发酵香肠中植物乳杆菌的快速定量检测方法，首先提取植物乳杆菌标准株的DNA，10倍梯度稀释后作为模板，用植物乳杆菌特异性引物对所得模板进行q‑PCR扩增，建立Ct值‑浓度标准曲线，其中横坐标为DNA浓度的对数，纵坐标为Ct值；然后提取发酵香肠样品中的菌株总DNA为模板，用植入物杆菌特异性引物进行q‑PCR扩增，得到待测样品中植物乳杆菌的Ct值，所得Ct值与步骤(3)的Ct值‑浓度标准曲线进行比对，得到待测样品的植物乳杆菌定量结果。本发明获得的拷贝数的结果比平板计数高约一个数量级，此外，与通过平板计数与线性方程所得活菌数的吻合度达到94％以上，说明本发明的方法可用于对植物乳杆菌的直接分析。

【技术领域】

本发明属于菌株计数、定量检测技术领域，特别是一种快速有效的植物乳杆菌定量检测方法。

【背景技术】

乳酸菌是一类革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性、无芽孢细菌的总称。乳酸菌作为发酵剂在肉制品发酵中可以缩短产品加工周期，改善产品的品质和风味，提高产品质量稳定性，同时也起到抑制腐败微生物的作用。因此，发酵肉制品中乳酸菌的含量是衡量肉制品质量的重要指标。

目前对发酵香肠中乳酸菌数的测定一般都采用传统的平板计数法，这种方法操作误差大、用时长、灵敏度低，无法准确迅速的反应出发酵过程中菌群的动态变化。所使用的选择性培养基会对菌体细胞的灵敏性产生影响，无法对有代谢活力但难以培养的菌体细胞进行计数。实时荧光定量省时、简单，具有很强的特异性和灵敏度，国内外已应用qPCR法对产品中的优势菌和致病菌进行检测，但至今还未有应用此方法对发酵香肠中的植物乳杆菌进行定量。因此，本发明具有广阔的应用前景。

【发明内容】

本发明的目的是克服现有技术缺点，提供一种基于q-PCR手段、计数准确度高的检测方法，能够对植物乳杆菌进行快速定量检测。

为了实现上述目的，本发明提供一种发酵香肠中植物乳杆菌的快速定量检测方法，所述方案包括以下步骤：

(1)植物乳杆菌标准株的DNA提取

将冻干保存的植物乳杆菌标准株接种至MRS液体培养基中，37℃下培养18h，连续活化增殖三代后，利用试剂盒进行菌株基因组DNA提取，用125μL TE buffer溶出DNA；用1％琼脂糖凝胶电泳和ND-1000微紫外分光光度计测量所得产物的质量浓度和光密度值，并将提取的DNA保存在-20℃下备用；

(2)标准品的制作

将步骤(1)得到的DNA原液的稀释至质量浓度100ng/μL得到扩增模板，用植物乳杆菌特异性引物进行PCR扩增，得到340bp目标片段；用1.0％的琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，然后在凝胶成像电泳仪的紫外灯下观察电泳结果，切取目的DNA条带，对目的DNA片段回收、纯化后，通过紫外分光光度计测量所得产物的质量浓度和OD_260nm/280nm处光密度值；

(3)建立Ct值-浓度标准曲线

将步骤(1)得到的DNA进行10倍梯度稀释，以所得浓度10^-1～10^-6的DNA稀释液作为模板，用植物乳杆菌特异性引物对所得模板进行q-PCR扩增，建立Ct值-浓度标准曲线，其中横坐标为DNA浓度的对数，纵坐标为Ct值；

其中，q-PCR的扩增程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸10min；

(4)待测发酵香肠样品中菌株总DNA的提取

对发酵香肠进行预处理，采用试剂盒提取待测待测发酵香肠样品中菌株的DNA，-20℃保存；

(5)待测样品中植物乳杆菌的定量分析