[发明专利]发酵香肠中植物乳杆菌的快速定量检测方法

权利要求书

1.发酵香肠中植物乳杆菌的快速定量检测方法，所述方案包括以下步骤：

(1)植物乳杆菌标准株的DNA提取

将冻干保存的植物乳杆菌标准株接种至MRS液体培养基中，37℃下培养18h，连续活化增殖三代后，利用试剂盒进行菌株基因组DNA提取，用125μL TE buffer溶出DNA；用1％琼脂糖凝胶电泳和ND-1000微紫外分光光度计测量所得产物的质量浓度和光密度值，并将提取的DNA保存在-20℃下备用；

(2)标准品的制作

将步骤(1)得到的DNA原液的稀释至质量浓度100ng/μL得到扩增模板，用植物乳杆菌特异性引物进行PCR扩增，得到340bp目标片段；用1.0％的琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，然后在凝胶成像电泳仪的紫外灯下观察电泳结果，切取目的DNA条带，对目的DNA片段回收、纯化后，通过紫外分光光度计测量所得产物的质量浓度和OD_260nm/280nm处光密度值；

(3)建立Ct值-浓度标准曲线

将步骤(1)得到的DNA进行10倍梯度稀释，以所得浓度10^-1～10^-6的DNA稀释液作为模板，用植物乳杆菌特异性引物对所得模板进行q-PCR扩增，建立Ct值-浓度标准曲线，其中横坐标为DNA浓度的对数，纵坐标为Ct值；

其中，q-PCR的扩增程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸10min；

(4)待测发酵香肠样品中菌株总DNA的提取

对发酵香肠进行预处理，采用试剂盒提取待测待测发酵香肠样品中菌株的DNA，-20℃保存；

(5)待测样品中植物乳杆菌的定量分析

以步骤(4)得到的DNA为样品模板，以无菌无酶水作为阴性对照模板，采用植物乳杆菌特异性引物进行q-PCR扩增，得到待测样品中植物乳杆菌的Ct值，所得Ct值与步骤(3)的Ct值-浓度标准曲线进行比对，得到待测样品的植物乳杆菌定量结果。

2.根据权利要求1所述的快速定量检测方法，其特征在于所述植物乳杆菌标准株是植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)37x-6，其于2018年8月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址100101北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.16189。

3.根据权利要求2所述的快速定量检测方法，其特征在于步骤(1)中进行DNA提取时，加入溶菌酶至以总体积浓度计70mg/mL，对标准菌株进行破壁。

4.根据权利要求3所述的快速定量检测方法，其特征在于所述特异性引物为：

lap F：AGCAGTAGGGAATCTTCCA

lap R：CACCGCTACACATGGAG。

5.根据权利要求1所述的快速定量检测方法，其特征在于步骤(2)的扩增体系为：PCRMIX 25μL，正向引物和反向引物各2μL，2μL DNA模板，无菌无酶水补充至50μL；反应程序为：95℃预变性7分钟；95℃变性30s，58℃退火1分钟，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸10分钟，4℃保存。

6.根据权利要求1所述的快速定量检测方法，其特征在于步骤(5)的q-PCR扩增体系为反应体系为20μL：10μL SYBR，0.4μL DyeⅢ，上下游引物各0.4μL，DNA模板2μL，ddH₂O 6.8μL。

7.根据权利要求1所述的快速定量检测方法，其特征在于步骤(4)中，对发酵香肠的预处理包括：取发酵肉肠220mg于2mL离心管中，在冰上操作；加入1.4mL bufferASL涡旋1min，然后95℃处理5min，再涡旋15s，然后12000rpm离心2min；

吸取1.2mL上清液于一新的2mL离心管中，加入1个inhibitEX Tablet到样品中，立刻涡旋1min，室温孵育1min使inhibitEX Tablet充分吸附抑制物；然后12000rpm离心6min，将所有的上清液转移到1.5mL离心管中，弃去沉淀，然后12000rpm 6min。取200μL所得上清液于含有15μL蛋白酶K的1.5mL离心管中，加入200μL的buffer AL，涡旋15S。然后70℃孵育10min，再加入体积浓度为96-100％的200μL的无水乙醇，涡旋混匀；

将混匀的溶解液转移到QIAamp spin colum柱中，12000离心2min；然后向柱子加入500μL buffer AW1，再12000rpm离心2min；再向柱子加入500μL buffer AW2，12000rpm离心6min，弃去含有离心液的收集管，然后12000rpm离心2min；

把上述QIAamp spin colum柱转移到新的离心管中，加入200μL AE，12000rpm离心2min，离心管中即为DNA。