[发明专利]基于静电亲和纳米转运载体及细胞成像的胞内microRNA非酶扩增检测方法

摘要

本发明公开一种基于静电亲和纳米转运载体和细胞成像的胞内microRNA非酶扩增检测方法。本发明采用非酶扩增体系，针对检测目标microRNA序列设计特异性带荧光标签的DNA发卡探针H1、H2序列；将H1、H2与纳米金颗粒组装成复合体，转运至肿瘤细胞，当扩增体系中含有待测microRNA，其可与H1结合，导致H1茎部打开，由此产生的部分单链结构与H2相作用，导致H2茎部打开，由此荧光基团FAM与淬灭基团BHQ‑1距离增大，荧光强度增加。用荧光分光光度计检测荧光强度，并用激光扫描共聚焦显微镜记录胞内成像情况。该方法原理简单且检测成本低；具有恒温无酶扩增、灵敏度高、操作简单、易于普及等优点。

主权项

1.一种基于静电亲和纳米转运载体及细胞成像的胞内microRNA非酶扩增检测方法，其特征在于包括以下步骤：(1)纳米金颗粒(AuNPs)的合成纳米金颗粒(AuNPs)的合成包括以下步骤：a、纳米金颗粒合成体系有PBS缓冲液、聚‑L‑赖氨酸PLL溶液、氯金酸溶液，最后加入无核酸酶水将体积补至体系所需体积，充分振荡混匀，全程避光；b、将步骤a所得溶液瞬时离心，使管盖沾粘的溶液落于管中，全程避光；c、将步骤b所得溶液放于恒温混匀仪中，恒温避光孵育；d、待步骤c溶液由黄色变为红色，指示纳米金颗粒的形成，放入4℃冰箱保存；(2)用于非酶扩增体系发卡探针的设计根据非酶扩增原理及待测microRNA序列设计非酶扩增体系所需的发卡探针H1及发卡探针H2序列：发卡探针H1采用双头标记策略，其5′端和3′端分别标记荧光基团FAM、淬灭基团BHQ‑1；H2的3′端标记荧光基团FAM，从5′端起第8个碱基腺嘌呤T标记淬灭基团BHQ‑1；发卡探针H1、H2用TE缓冲液溶解即可，终浓度均为100μM，保存于‑20℃冰箱；(3)发卡探针预处理为了使发卡探针H1、H2充分形成发卡结构，向发卡探针H1、H2溶液中分别加入磷酸盐缓冲液PBS，并将PBS终浓度设置为1×；随后，加热至95℃之后，使其充分变性；最后，梯度降温，降至常温为止，分别得到发卡探针H1、H2的预处理产物，产物保存于4℃或‑20℃环境中备用；H1、H2形成充分的发卡结构后，荧光基团FAM与淬灭基团BHQ‑1相互作用，荧光淬灭；(4)胞外非酶扩增检测体系的构建取一定量步骤(3)中得到的发卡探针H1、H2的预处理产物，并加入PBS缓冲液，再加入RNA酶抑制剂，最后加DEPC水至检测体系所需体积，充分混匀；(5)胞外非酶扩增检测体系的验证及其灵敏度、特异性检测分别在步骤(4)非酶扩增检测体系中加入不同浓度的待测microRNA，温浴，用荧光分光光度计检测所得溶液的荧光强度，并确定非酶扩增体系的灵敏度；设置Control组，然后分别在步骤(4)非酶扩增检测体系中加入相同浓度的待测microRNA以及与待测microRNA碱基序列类似的microRNA210、microRNA214，温浴，用荧光分光光度计检测所得溶液的荧光强度，并确定非酶扩增体系的特异性；(6)非酶扩增纳米金颗粒转运体系的构建取一定量步骤(3)中得到的发卡探针H1、H2的预处理产物，加入到步骤(1)所得的AuNPs溶液中，充分混匀后，温浴；(7)肿瘤细胞非酶扩增纳米金复合体的转运取一定量步骤(6)所得溶液，加入到肿瘤细胞中，随后放到37℃二氧化碳培养箱中孵育，至少1小时；(8)细胞核与骨架的染色将步骤(7)中孵育过后的产物从二氧化碳培养箱中取出，然后进行细胞核与骨架的染色，再进行显微镜观察，或放入4℃冰箱避光保存；(9)细胞荧光强度的检测与胞内成像将步骤(8)中所得最终产物，用激光扫描共聚焦显微镜观察细胞胞内成像情况，并记录数据。