[发明专利]一种基于引物激活的碱基突变序列扩增检测方法

摘要

本发明涉及一种基于引物激活的碱基突变序列扩增检测方法，包括：(1)提供包括基因组DNA、第一类引物、第二类引物、第三类引物、核苷酸单体混合物、核糖核酸内切酶和核酸聚合酶的反应混合物；(2)在所述反应混合物中，当所述第一类引物与基因组DNA在目标碱突变基位点结合，核糖核酸内切酶能够剪切所述第一类引物的3’端，得到被激活的引物；(3)将步骤(2)得到的反应混合物置于恒定温度，发生恒温链置换扩增反应以得到扩大的基因组扩增产物；(4)分析所述扩增产物以识别目标碱基类型。本发明所述的基于引物激活的碱基突变序列扩增检测方法灵敏度高、特异性强，并且恒温闭管一步反应，可以有效避免交叉污染。

主权项

1.一种基于引物激活的碱基突变序列扩增检测方法，所述方法包括：(1)提供反应混合物，其中所述反应混合物包括基因组DNA、第一类引物、第二类引物、第三类引物、核苷酸单体混合物、核糖核酸内切酶和核酸聚合酶的反应混合物，其中所述的第一类引物、第二类引物和第三类引物分别与所述基因组DNA中目标碱基位点前后的一段或两段序列一致或互补，条件是所述的第一类引物3’端序列与基因组DNA在目标碱基位点互补，并且所述的第一类引物中与目标碱基互补的碱基为核糖核苷酸，同时所述的第一类引物在3’端修饰有核酸聚合酶延伸反应阻断基团，所述的第二类引物和第三类引物仅由脱氧核糖核酸组成并且3’端可被核酸聚合酶延伸；(2)将所述反应混合物置于反应温度，所述的第一类引物与基因组DNA在目标碱基位点结合，使得核糖核酸内切酶能够水解所述的第一类引物中核糖核苷酸上游的磷酸二酯键，去除所述第一类引物3’端修饰的核酸聚合酶延伸反应阻断基团，得到3’端可被核酸聚合酶延伸的激活的引物产物；(3)步骤(2)中所述的激活的引物产物能够与所述反应混合物所述第二类引物和第三类引物分别与所述基因组DNA在目标碱基位点前后杂交，并进一步在核酸聚合酶作用下进行恒温链置换核酸扩增以得到目标碱基特异的序列扩增产物；(4)分析所述扩增产物以识别目标碱基类型，包括实时荧光分析、实时浊度分析，其中在所述步骤(2)、所述步骤(3)和所述步骤(4)之前提供所述反应混合物。