[发明专利]一种基于引物激活的碱基突变序列扩增检测方法

说明书

本发明涉及一种基于引物激活的碱基突变序列扩增检测方法，包括：(1)提供包括基因组DNA、第一类引物、第二类引物、第三类引物、核苷酸单体混合物、核糖核酸内切酶和核酸聚合酶的反应混合物；(2)在所述反应混合物中，当所述第一类引物与基因组DNA在目标碱突变基位点结合，核糖核酸内切酶能够剪切所述第一类引物的3’端，得到被激活的引物；(3)将步骤(2)得到的反应混合物置于恒定温度，发生恒温链置换扩增反应以得到扩大的基因组扩增产物；(4)分析所述扩增产物以识别目标碱基类型。本发明所述的基于引物激活的碱基突变序列扩增检测方法灵敏度高、特异性强，并且恒温闭管一步反应，可以有效避免交叉污染。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，尤其是涉及一种基于引物激活的碱基突变序列扩增检测方法。

背景技术

碱基突变在生物界中普遍存在，主要是指在基因组水平发生碱基对的替换、增添和缺失，而引起的基因结构的改变。它包括单个碱基改变所引起的点突变，或多个碱基的缺失、重覆和插入。基因突变既可来自家族的遗传，又可源于因环境等改变产生的随机突变。因碱基突变通常会改变其所在基因表达蛋白的性状，或引起其相关RNA与蛋白表达水平的改变，从而对生物体产生危害。

近几年，碱基突变的检测方法层出不穷，同时经典的方法也在不断地被改进。目前较为常见的方法主要包括传统的PCR-高通量测序技术和PCR-焦磷酸测序技术，以及新兴的ARMS-PCR技术(amplification refractory mutation system)、HRM技术(high-resolution melting analysis)、PNA-探针法及流式荧光杂交等。前两种检测方式都是先将目的基因先进行PCR扩增再进行测序。ARMS-PCR技术是通过一对特殊的引物扩增得到正常序列和突变序列的PCR产物，再根据溶解曲线的不同来区分检测位点的突变类型。HRM是根据基因序列的长短、GC含量及碱基互补的不同，采用高分辨率的溶解曲线对样品进行分析。PNA-探针法及流式荧光杂交是灵敏度和准确度极高的基因检测方法。然而，上述方法在碱基突变的检测中通常存在分析周期长、灵敏度低、特异性有限、成本高，或者操作繁琐复杂、对操作人员技术要求高、易造成样品污染、仪器平台复杂等问题。

因此，目前急需一种能够克服主流碱基突变检测方法的一个、多个或全部缺陷的改进的碱基突变检测方法。

发明内容

本发明提供了一种基于引物激活的碱基突变序列扩增检测方法，以解决现有方法特异性不高、灵敏度低、交叉污染、操作复杂、效率低下、成本高等问题。所述方法包括：

(1)提供反应混合物，其中所述反应混合物包括基因组DNA、第一类引物、第二类引物、第三类引物、核苷酸单体混合物、核糖核酸内切酶和核酸聚合酶的反应混合物，其中所述的第一类引物、第二类引物和第三类引物分别与所述基因组DNA中目标碱基位点前后的一段或两段序列一致或互补，条件是所述的第一类引物3’端序列与基因组DNA在目标碱基位点互补，并且所述的第一类引物中与目标碱基互补的碱基为核糖核苷酸，同时所述的第一类引物在3’端修饰有核酸聚合酶延伸反应阻断基团，所述的第二类引物和第三类引物仅由脱氧核糖核酸组成并且3’端可被核酸聚合酶延伸；

(2)将所述反应混合物置于反应温度，所述的第一类引物与基因组DNA在目标碱基位置互补，使得核糖核酸内切酶能够水解所述的第一类引物中核糖核苷酸上游的磷酸二酯键，去除所述第一类引物3’端修饰的核酸聚合酶延伸反应阻断基团，得到3’端可被核酸聚合酶延伸的激活的引物产物；

(3)步骤(2)中所述的激活的引物产物能够与所述反应混合物所述第二类引物和第三类引物分别与所述基因组DNA在目标碱基前后杂交，并进一步在核酸聚合酶作用下进行恒温链置换核酸扩增以得到目标碱基特异的序列扩增产物；

(4)分析所述扩增产物以识别目标碱基类型，包括实时荧光分析、实时浊度分析，其中在所述步骤(2)、所述步骤(3)和所述步骤(4)之前提供所述反应混合物。