[发明专利]一种基于引物激活的碱基突变序列扩增检测方法

权利要求书

1.一种基于引物激活的碱基突变序列扩增检测方法，所述方法包括：

(1)提供反应混合物，其中所述反应混合物包括基因组DNA、第一类引物、第二类引物、第三类引物、核苷酸单体混合物、核糖核酸内切酶和核酸聚合酶的反应混合物，其中所述的第一类引物、第二类引物和第三类引物分别与所述基因组DNA中目标碱基位点前后的一段或两段序列一致或互补，条件是所述的第一类引物3’端序列与基因组DNA在目标碱基位点互补，并且所述的第一类引物中与目标碱基互补的碱基为核糖核苷酸，同时所述的第一类引物在3’端修饰有核酸聚合酶延伸反应阻断基团，所述的第二类引物和第三类引物仅由脱氧核糖核酸组成并且3’端可被核酸聚合酶延伸；

(2)将所述反应混合物置于反应温度，所述的第一类引物与基因组DNA在目标碱基位点结合，使得核糖核酸内切酶能够水解所述的第一类引物中核糖核苷酸上游的磷酸二酯键，去除所述第一类引物3’端修饰的核酸聚合酶延伸反应阻断基团，得到3’端可被核酸聚合酶延伸的激活的引物产物；

(3)步骤(2)中所述的激活的引物产物能够与所述反应混合物所述第二类引物和第三类引物分别与所述基因组DNA在目标碱基位点前后杂交，并进一步在核酸聚合酶作用下进行恒温链置换核酸扩增以得到目标碱基特异的序列扩增产物；

(4)分析所述扩增产物以识别目标碱基类型，包括实时荧光分析、实时浊度分析，

其中在所述步骤(2)、所述步骤(3)和所述步骤(4)之前提供所述反应混合物。

2.根据权利要求1中所述的方法，其中所述第一类引物从5’端到3’端包含与所述基因组DNA中位与目标碱基上游5’端一致的序列、与目标碱基互补的序列、3’端修饰的核酸聚合酶延伸反应阻断基团，以及在与目标碱基互补处的碱基为能与天然核酸进行配对的核糖核苷酸。

3.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述第一类引物中与目标碱基前后互补的序列在与目标碱基互补处的碱基为核糖核苷酸，条件是核糖核苷酸位于3’端上游的2-10个碱基处。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述3’端修饰的核酸聚合酶延伸反应阻断基团可选自：不可被延伸的核苷酸或可阻断核酸聚合酶延伸的其它基团。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述第二类引物从5’端到3’端包含与所述基因组DNA目标碱基位点上游5’端互补的序列和更远上游一致的序列，条件是所述第二类引物与所述基因组DNA的互补区间不同于所述第一类引物在所述基因组DNA的覆盖区间，并且位于所述第一类引物在所述基因组DNA的覆盖区间的5’端上游。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述第三类引物包含与所述基因组DNA目标碱基位点上游5’端一致的序列或下游3’端互补的序列，条件是所述第三类引物在所述基因组中所覆盖的序列范围位于所述第一类引物和所述第二类引物覆盖序列范围的外侧，并且覆盖范围不重叠。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述核糖核酸内切酶具有热稳定和内切酶活性。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述核糖核酸内切酶选自：RNase H、RNase A，及其任意组合。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述核酸聚合酶具有热稳定和/或链置换活性。