[发明专利]一种乳腺癌21基因检测试剂盒及其检测方法

摘要

本发明公开了一种乳腺癌21基因检测试剂盒及其检测方法；所述试剂盒包括分别检测ACTB、GAPDH、RPLPO、GUS、TFRC、CD68、BAG1、GSTM1、HER2、GRB7、MMP11、CTSL2、KI67、STK15、CCNB1、MYBL2、Survivin、ESR1、PGR、BCL2和SCUBE2基因的引物和探针，试剂盒中21个基因各设计了两对引物和2条特异性探针，每个基因的引物和探针混合液放在一个反应管中，在QPCR上扩增时使用同一种缓冲液和程序，操作简便、节省检测时间并得到清晰准确的结果；本试剂盒适用广泛，对于科研和临床检测都适用，单或多样品，都能使用本试剂盒，检测结果快速准确。

主权项

1.一种乳腺癌21基因检测试剂盒，其特征是21个基因为：ACTB、GAPDH、RPLPO、GUS、TFRC、CD68、BAG1、GSTM1、HER2、GRB7、MMP11、CTSL2、KI67、STK15、CCNB1、MYBL2、Survivin、ESR1、PGR、BCL2和SCUBE2；试剂盒中针对21个基因各设计了两对引物和2条特异性探针，21个基因所对应的引物序列和TaqMan探针序列分别如下：（1）检测ACTB基因的引物序列为：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，检测ACTB基因的TaqMan探针序列为：SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；具体序列如下：ACTB：F1:5'‑CCAACTTGAGATGTATGAAG ‑3'                 （SEQ ID NO.1）R1:5'‑GTCAGTGTACAGGTAAGC ‑3'                   （SEQ ID NO.2）F2:5'‑TGGAGAAGAGCTACGA ‑3'                     （SEQ ID NO.3）R2:5'‑GAAGGAAGGCTGGAAG ‑3'                     （SEQ ID NO.4）P1:5'FAM‑CTGCCTCCACCCACTCCC‑3'MGB              （SEQ ID NO.5）P2:5'VIC‑CGGAACCGCTCATTGCCA‑3'MGB              （SEQ ID NO.6）；（2）检测GAPDH基因的引物序列为：SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10，检测GAPDH基因的TaqMan探针序列为：SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12；具体序列如下：GAPDH：F1:5'‑GCCTCCAAGGAGTAAGA ‑3'                    （SEQ ID NO.7）R1:5'‑GCAGTGAGGGTCTCTC ‑3'                     （SEQ ID NO.8）F2:5'‑CCATGACAACTTTGGTATCA ‑3'                 （SEQ ID NO.9）R2:5'‑GCCATCCACAGTCTTCA ‑3'                    （SEQ ID NO.10）P1:5'FAM‑TCCTCTTGTGCTCTTGCTGG‑3'MGB            （SEQ ID NO.11）P2:5'VIC‑AGTCCATGCCATCACTGCCA‑3'MGB            （SEQ ID NO.12）；（3）检测RPLPO基因的引物序列为：SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16，检测RPLPO基因的TaqMan探针序列为：SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18；具体序列如下：RPLPO：F1:5'‑‑GGTTGAAGCCAAGGAAGA ‑3'                  （SEQ ID NO.13）R1:5'‑TGGTGATTAGTCAAAGAGACC ‑3'                （SEQ ID NO.14）F2:5'‑GGGCACCATTGAAATCCA ‑3'                   （SEQ ID NO.15）R2:5'‑GGAGATGTTGAGCATGTTCA ‑3'                 （SEQ ID NO.16）P1:5'FAM‑ATCCTCGTCCGACTCCTCCG‑3'MGB            （SEQ ID NO.17）P2:5'VIC‑CGTGGCTTCGCTGGCTCC‑3'MGB              （SEQ ID NO.18）；（4）检测GUS基因的引物序列为：SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22，检测GUS基因的TaqMan探针序列为：SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24；具体序列如下：GUS：F1:5'‑CCACAGCAGCAGAACA‑3'                      （SEQ ID NO.19）R1:5'‑ CTGCTAGAATAGATGACCACAA‑3'               （SEQ ID NO.20）F2:5'‑GGTGTCAACAAGCATGAGA ‑3'                  （SEQ ID NO.21）R2:5'‑CAGCGAAGCAGGTTGAA ‑3'                    （SEQ ID NO.22）P1:5'FAM‑CCTCCTGGACTGTTCACGGC‑3'MGB            （SEQ ID NO.23）P2:5'VIC‑TCCTTCACCAGCAGCGGC‑3'MGB              （SEQ ID NO.24）；（5）检测TFRC基因的引物序列为：SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28，检测TFRC基因的TaqMan探针序列为：SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30；具体序列如下：TFRC：F1:5'‑GGACTGACATTTAGCGTAG ‑3'                  （SEQ ID NO.25）R1:5'‑GCCACATGCTTTCATTTAAG ‑3'                 （SEQ ID NO.26）F2:5'‑GAGAGGATTCCTGAGTTGAA ‑3'                 （SEQ ID NO.27）R2:5'‑TCCAGGTTCAATTCAACATCA ‑3'                （SEQ ID NO.28）P1:5'FAM‑TGCGTAACACCCGAACCAGG‑3'MGB            （SEQ ID NO.29）P2:5'VIC‑CACGAACTGACCAGCGACCT‑3'MGB            （SEQ ID NO.30）；（6）检测CD68基因的引物序列为SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32和SEQ ID NO.33和SEQ ID NO.34，检测CD68基因的TaqMan探针序列为：SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.36；具体序列如下：CD68：F1:5'‑GGCAGAACTGCTTGAA ‑3'                     （SEQ ID NO.31）R1:5'‑GCGATCTTGGCTTAGTG ‑3'                    （SEQ ID NO.32）F2:5'‑ACCTGCTTCTCTCATTCCA ‑3'                  （SEQ ID NO.33）R2:5'‑CTCCACCGCCATGTAGA ‑3'                    （SEQ ID NO.34）P1:5'FAM‑CGGCTCACTGCAACCTCCA‑3'MGB             （SEQ ID NO.35）P2:5'VIC‑CCTTCTGCTGGAGGTCCTGC‑3'MGB            （SEQ ID NO.36）；（7）检测BAG1基因的引物序列为：SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.38和SEQ ID NO.39和SEQ ID NO.40，检测BAG1基因的TaqMan探针序列为：SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.42；具体序列如下：BAG1：F1:5'‑GCTACTACCTCTGCTTGA ‑3'                   （SEQ ID NO.37）R1:5'‑GTGAGTTGAATTCTGAAGGA ‑3'                 （SEQ ID NO.38）F2:5'‑CCACAGGCCATGAGATAA ‑3'                   （SEQ ID NO.39）R2:5'‑GGTTCTAACCTTCTGAAGACA ‑3'                （SEQ ID NO.40）P1:5'FAM‑TCCTCACCTTCCTTCCTCCA‑3'MGB            （SEQ ID NO.41）P2:5'VIC‑CCGTTCCTTGGATGGAGCCT‑3'MGB            （SEQ ID NO.42）；（8）检测GSTM1基因的引物序列为：SEQ ID NO.43和SEQ ID NO.44和SEQ ID NO.45和SEQ ID NO.46，检测GSTM1基因的TaqMan探针序列为：SEQ ID NO.47和SEQ ID NO.48；具体序列如下：GSTM1：F1:5'‑CCCATCATTACCCTTCC ‑3'                    （SEQ ID NO.43）R1:5'‑GCCCTTTAAAGCAGACA ‑3'                    （SEQ ID NO.44）F2:5'‑GAGGGCTTGGAGAAGAA ‑3'                    （SEQ ID NO.45）R2:5'‑GACAGCCATCTTTGAGAAA ‑3'                  （SEQ ID NO.46）P1:5'FAM‑AGCCAGCCTGACCTTCCTTC‑3'MGB            （SEQ ID NO.47）P2:5'VIC‑AGTCCAGCCGCTTCCTCC‑3'MGB              （SEQ ID NO.48）；（9）检测HER2基因的引物序列为：SEQ ID NO.49和SEQ ID NO.50和SEQ ID NO.51和SEQ ID NO.52，检测HER2基因的TaqMan探针序列为：SEQ ID NO.53和SEQ ID NO.54；具体序列如下：HER2：F1:5'‑CTCCGACCACTTCCAG ‑3'                     （SEQ ID NO.49）R1:5'‑CCCTTCCAGCCATCTG ‑3'                     （SEQ ID NO.50）F2:5'‑GGTGGTTGGCATTCTGA ‑3'                    （SEQ ID NO.51）R2:5'‑CCGCATCGTGTACTTC ‑3'                     （SEQ ID NO.52）P1:5'FAM‑CTGCCATGCCAGGAACCTGT‑3'MGB            （SEQ ID NO.53）P2:5'VIC‑TTCTGCTGCCGTCGCTTGA‑3'MGB             （SEQ ID NO.54）；（10）检测GRB7基因的引物序列为：SEQ ID NO.55和SEQ ID NO.56和SEQ ID NO.57和SEQ ID NO.58，检测GRB7基因的TaqMan探针序列为：SEQ ID NO.59和SEQ ID NO.60；具体序列如下：GRB7：F1:5'‑CCTCCCTCAGATAGAA ‑3'                     （SEQ ID NO.55）R1:5'‑GCTAGGAGAAGGAGAG ‑3'                     （SEQ ID NO.56）F2:5'‑GGCTTCGGATCTTCTGA ‑3'                    （SEQ ID NO.57）R2:5'‑CCGTACTTGAAGAGGC ‑3'                     （SEQ ID NO.58）P1:5'FAM‑CCACTCCAGTCCACTCCTGA‑3'MGB            （SEQ ID NO.59）P2:5'VIC‑AGATGAGCAGAGCCGCACC‑3'MGB             （SEQ ID NO.60）；（11）检测MMP11基因的引物序列为：SEQ ID NO.61和SEQ ID NO.62和SEQ ID NO.63和SEQ ID NO.64，检测MMP11基因的TaqMan探针序列为：SEQ ID NO.65和SEQ ID NO.66；具体序列如下：MMP11：F1:5'‑AGGTCAGGTCTTGGTA ‑3'                     （SEQ ID NO.61）R1:5'‑CTGGATTCTGGAGAACA ‑3'                    （SEQ ID NO.62）F2:5'‑‑CCAGATGCCTGTGAGGA ‑3'                   （SEQ ID NO.63）R2:5'‑AGCCCGCTTTGAAGAA ‑3'                     （SEQ ID NO.64）P1:5'FAM‑TTCTGGCTGACAATCCTGGA‑3'MGB            （SEQ ID NO.65）P2:5'VIC‑TCCACCATCCGAGGCGAGC‑3'MGB             （SEQ ID NO.66）；（12）检测CTSL2基因的引物序列为：SEQ ID NO.67和SEQ ID NO.68和SEQ ID NO.69和SEQ ID NO.70；检测CTSL2基因的TaqMan探针序列为：SEQ ID NO.71和SEQ ID NO.72；具体序列如下：CTSL2：F1:5'‑CCTAGATGGTATAGCCTATTAC ‑3'               （SEQ ID NO.67）R1:5'‑AGCACAGTGATGTGTTG ‑3'                    （SEQ ID NO.68）F2:5'‑GGCTGGTCTTGAACTCA ‑3'                    （SEQ ID NO.69）R2:5'‑TGGCTCACATCTGTAATC ‑3'                   （SEQ ID NO.70）P1:5'FAM‑TGGTACAGCCTGTTGCTCCT‑3'MGB            （SEQ ID NO.71）P2:5'VIC‑CCACCTGCCTCAGCCTCC‑3'MGB              （SEQ ID NO.72）；（13）检测KI67基因的引物序列为：SEQ ID NO.73和SEQ ID NO.74和SEQ ID NO.75和SEQ ID NO.76，检测KI67基因的TaqMan探针序列为：SEQ ID NO.77和SEQ ID NO.78；具体序列如下：KI67：F1:5'‑CTCTGTACCTACCATCTCC ‑3'                  （SEQ ID NO.73）R1:5'‑CAGGAGGGAAAGTTCCA ‑3'                    （SEQ ID NO.74）F2:5'‑GGGAAAGTAGGTGTGAAAGA ‑3'                 （SEQ ID NO.75）R2:5'‑CCATCTCCTGCTGTCTC ‑3'                    （SEQ ID NO.76）P1:5'FAM‑AGGCACCTCCAACCACCACA‑3'MGB            （SEQ ID NO.77）P2:5'VIC‑ACCAGTCGGCAAGCTCACAC‑3'MGB            （SEQ ID NO.78）；（14）检测STK15基因的引物序列为：SEQ ID NO.79和SEQ ID NO.80和SEQ ID NO.81和SEQ ID NO.82，检测STK15基因的TaqMan探针序列为：SEQ ID NO.83和SEQ ID NO.84；具体序列如下：STK15：F1:5'‑ACAGGAGGCAAATCC ‑3'                      （SEQ ID NO.79）R1:5'‑CAGGTACTAGGAAGGTTATTG ‑3'                （SEQ ID NO.80）F2:5'‑GGGTGGTCAGTACATGA ‑3'                    （SEQ ID NO.81）R2:5'‑CATCCGACCTTCAATCA ‑3'                    （SEQ ID NO.82）P1:5'FAM‑TGACCACTCTGCCCTGACCC‑3'MGB            （SEQ ID NO.83）P2:5'VIC‑TCCATCTTCCAGGAGGACCA‑3'MGB            （SEQ ID NO.84）；（15）检测CCNB1基因的引物序列为：SEQ ID NO.85和SEQ ID NO.86和SEQ ID NO.87和SEQ ID NO.88，检测CCNB1基因的TaqMan探针序列为：SEQ ID NO.89和SEQ ID NO.90；具体序列如下：CCNB1：F1:5'‑CTGTCAAGAACAAGTATGC ‑3'                  （SEQ ID NO.85）R1:5'‑CACAGCCTTGGCTAAA ‑3'                     （SEQ ID NO.86）F2:5'‑ATCGGTTCATGCAGAATAATTGA ‑3'              （SEQ ID NO.87）R2:5'‑GGAGGGTACATTTCTTCATATTTG ‑3'             （SEQ ID NO.88）P1:5'FAM‑AAGATCAGCACTCTACCACAGC‑3'MGB          （SEQ ID NO.89）P2:5'VIC‑TGGCAGTGACACCAACCAGC‑3'MGB            （SEQ ID NO.90）；（16）检测MYBL2基因的引物序列为：SEQ ID NO.91和SEQ ID NO.92和SEQ ID NO.93和SEQ ID NO.94，检测MYBL2基因的TaqMan探针序列为：SEQ ID NO.95和SEQ ID NO.96；具体序列如下：MYBL2：F1:5'‑CAGACTCTCAGGTGGA ‑3'                     （SEQ ID NO.91）R1:5'‑GACCTGGAAGTGGAAC ‑3'                     （SEQ ID NO.92）F2:5'‑GCCCTCTGTGCTCAAGA ‑3'                    （SEQ ID NO.93）R2:5'‑CAGACTGGTGCTATTCTCA ‑3'                  （SEQ ID NO.94）P1:5'FAM‑AGCACCAGGAGCCGCC‑3'MGB                （SEQ ID NO.95）P2:5'VIC‑CACACGCCTCTTCCTCTGCC‑3'MGB            （SEQ ID NO.96）；（17)检测Survivin基因的引物序列为：SEQ ID NO.97和SEQ ID NO.98和SEQ ID NO.99和SEQ ID NO.100，检测Survivin基因的TaqMan探针序列为SEQ ID NO.101和SEQ ID NO.102；具体序列如下：Survivin：F1:5'‑GCCATCCTTAAAACCAGA ‑3'                   （SEQ ID NO.97）R1:5'‑CGGTTGCACTTAGACAA ‑3'                    （SEQ ID NO.98）F2:5'‑CCTTCACATCTGTCACGA ‑3'                   （SEQ ID NO.99）R2:5'‑GCTGCCTCCAAAGAAAG ‑3'                    （SEQ ID NO.100）P1:5'FAM‑CCTCATGGCTACCAGCACCT‑3'MGB            （SEQ ID NO.101）P2:5'VIC‑ACGCAGTCCGCCCAGGT‑3'MGB               （SEQ ID NO.102）；（18）检测ESR1基因的引物序列为：SEQ ID NO.103和SEQ ID NO.104和SEQ ID NO.105和SEQ ID NO.106，检测ESR1基因的TaqMan探针序列为：SEQ ID NO.107和SEQ ID NO.108；具体序列如下：ESR1：F1:5'‑GCACCCTAGAAACAACATA ‑3'                  （SEQ ID NO.103）R1:5'‑GTCTCTATAACCAATGACCTC ‑3'                （SEQ ID NO.104）F2:5'‑CTGGTGATTGTCAATTCATTCA ‑3'               （SEQ ID NO.105）R2:5'‑GCAGTGTATCAAGTTAAAATAGTC ‑3'             （SEQ ID NO.106）P1:5'FAM‑AGGTGCCTGAGACACAGACC‑3'MGB            （SEQ ID NO.107）P2:5'VIC‑TCTGCCTTCCCTGTGTGCCC‑3'MGB            （SEQ ID NO.108）；（19）检测PGR基因的引物序列为：SEQ ID NO.109和SEQ ID NO.110和SEQ ID NO.111和SEQ ID NO.112，检测PGR基因的TaqMan探针序列为：SEQ ID NO.113和SEQ ID NO.114；具体序列如下：PGR：F1:5'‑TGCCAAGAAGGTGAAAC ‑3'                    （SEQ ID NO.109）R1:5'‑ACAGCTTTGCATTGTCA ‑3'                    （SEQ ID NO.110）F2:5'‑CATGGAATGTCAACCTGTAA ‑3'                 （SEQ ID NO.111）R2:5'‑GCACAGTCCTATGTCAG ‑3'                    （SEQ ID NO.112）P1:5'FAM‑CCATCACTGCCAGGGACCCA‑3'MGB            （SEQ ID NO.113）P2:5'VIC‑CTCCACAGTGCCCATCATCA‑3'MGB            （SEQ ID NO.114）；（20）检测BCL2基因的引物序列为：SEQ ID NO.115和SEQ ID NO.116和SEQ ID NO.117和SEQ ID NO.118，检测BCL2基因的TaqMan探针序列为：SEQ ID NO.119和SEQ ID NO.120；具体序列如下：BCL2：F1:5'‑GGGTATGAAGGACCTGTA ‑3'                   （SEQ ID NO.115）R1:5'‑ GTCGTACCACAAACTTCAAA‑3'                 （SEQ ID NO.116）F2:5'‑GTGAGGAGAGGCAATGA ‑3'                    （SEQ ID NO.117）R2:5'‑CCTTGCTTTAAACTCACAG ‑3'                  （SEQ ID NO.118）P1:5'FAM‑TGCCTCTGCGAAGAACCTTG‑3'MGB            （SEQ ID NO.119）P2:5'VIC‑CAGCCAACGTGCCATGTGC‑3'MGB             （SEQ ID NO.120）；和（21)检测SCUBE2基因的引物序列为：SEQ ID NO.121和SEQ ID NO.122和SEQ ID NO.123和SEQ ID NO.124，检测SCUBE2基因的TaqMan探针序列为：SEQ ID NO.125和SEQ ID NO.126；具体序列如下：SCUBE2：F1:5'‑CCCAGTCTCAAATGTGA ‑3'                    （SEQ ID NO.121）R1:5'‑GCTGTTACTGTTAGAGAATGA ‑3'                （SEQ ID NO.122）F2:5'‑GTGTCAACCTGGTGAATAA ‑3'                  （SEQ ID NO.123）R2:5'‑GGGAAGCAGGAAGTTC ‑3'                     （SEQ ID NO.124）P1:5'FAM‑TCCGTGGACATGAGCAGCC‑3'MGB             （SEQ ID NO.125）P2:5'VIC‑ACCTTGCCAGCTCTGTGCC‑3'MGB             （SEQ ID NO.126）；其中，TaqMan探针序列的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有淬灭基团。