[发明专利]一种提高酪氨酸酚裂解酶催化生产左旋多巴效率的方法在审
| 申请号： | 201810907732.7 | 申请日： | 2018-08-10 |
| 公开（公告）号： | CN110055291A | 公开（公告）日： | 2019-07-26 |
| 发明（设计）人： | 储消和;吴黎诚;生英涛;陈万河;程跃;徐顺清;沈建;方明山;余炜;柳鹏福;孙俊杰 | 申请（专利权）人： | 浙江工业大学;浙江绿创生物科技有限公司 |
| 主分类号： | C12P13/22 | 分类号： | C12P13/22;C12N9/88 |
| 代理公司： | 杭州赛科专利代理事务所(普通合伙) 33230 | 代理人： | 尹建民 |
| 地址： | 310014 浙*** | 国省代码： | 浙江;33 |
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| 摘要： | 本发明涉及一种提高酪氨酸酚裂解酶催化生产左旋多巴效率的方法，其特征在于：(1)挑单菌落接种到含LB培养基的试管中，加卡那霉素(50mg/L)30‑37℃，220rpm，培养12‑16h，得到一级种子；(2)将所述一级种子接种到含发酵培养基的摇瓶中培养10‑12h；(3)离心收菌，得到菌体，超声破胞，高速离心，获得上清酶液；(4)酶液加入底物溶液，搅匀，25℃，密封震荡反应；所述底物溶液包括14‑16g/L的丙酮酸钠、10‑12g/L的邻苯二酚、50‑60g/L的醋酸铵、2‑5g/L的亚硫酸钠、1‑3g/L的EDTA，调pH7.5‑8.5，反应产物浓度达到20g/L以上，加入10‑30g/L的左旋多巴晶体，诱导产品提前析晶。本发明大大提高了转化率和产物浓度，提高了产品品质，工艺简单，成本低廉，产率高，具有工业化生产的应用价值。 | ||
| 搜索关键词： | 左旋多巴 催化生产 底物溶液 一级种子 酪氨酸 裂解酶 接种 发酵培养基 丙酮酸钠 产品品质 超声破胞 高速离心 卡那霉素 离心收菌 邻苯二酚 上清酶液 亚硫酸钠 震荡反应 醋酸铵 单菌落 试管 产率 搅匀 菌体 酶液 析晶 摇瓶 密封 诱导 应用 | ||
【主权项】：
1.一种提高酪氨酸酚裂解酶催化生产左旋多巴效率的方法，其特征在于：(1)挑单菌落接种到含LB培养基的试管中，加卡那霉素(50mg/L)30‑37℃，220rpm，培养12‑16h，得到一级种子；(2)将所述一级种子接种到含发酵培养基的摇瓶中，30‑37℃，200‑250rpm，培养2‑5h，加IPTG至终浓度0.6mM，28‑32℃，180‑220rpm，培养10‑12h；所述发酵培养基组分如下：胰蛋白胨12g/L、酵母提取物24g/L、甘油5g/L，磷酸二氢钾2.31g/L、三水磷酸氢二钾16.43g/L；(3)离心收菌，得到菌体，超声破胞，高速离心，获得上清酶液；(4)酶液加入底物溶液，搅匀，25℃，密封震荡反应；所述底物溶液包括14‑16g/L的丙酮酸钠、10‑12g/L的邻苯二酚、50‑60g/L的醋酸铵、2‑5g/L的亚硫酸钠、1‑3g/L的EDTA，调pH7.5‑8.5，反应产物浓度达到20g/L以上，加入10‑30g/L的左旋多巴晶体，诱导产品提前析晶。
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- 本发明涉及L‑苯丙氨酸的制备方法，包括如下步骤：向配料罐中加入水和第一培养基，得到第一培养液，再将其打入种子罐中，然后调节其pH值并灭菌，然后冷却，再加入液体葡萄糖并调节其pH值，再接种大肠杆菌；将液体葡萄糖打入消糖罐中定容，再灭菌并冷却；将磷酸氢二钾和磷酸二氢钾投入补料罐中定容，再灭菌并冷却；向配料罐中加入水和不含葡萄糖的第二培养基，得到第二培养液，然后将第二培养液打入发酵罐中并灭菌，然后将其温度降至31℃～33℃，再加入已灭菌的液体葡萄糖，然后调节其pH，然后将种子罐中的菌种移种到发酵罐中进行发酵，得到L‑苯丙氨酸。本发明的L‑苯丙氨酸的制备方法，减少了发酵培养基中的有害色素，提高了产酸和发酵水平。
- L‑色氨酸的发酵和提取工艺-201610360760.2
- 赵春光;哈志瑞;孟刚;马文友;陈崇安;詹志林;马吉银 - 宁夏伊品生物科技股份有限公司
- 2016-05-29 - 2017-05-24 - C12P13/22
- 本发明属于氨基酸发酵领域，其提供了发酵生产L‑色氨酸的方法，包括改造细菌染色体上的野生型的tdcD基因或其调控元件，使改造获得的细菌的tdcD酶的表达量和/或酶活性降低。另外，本发明还包括对发酵获得的L‑色氨酸发酵液分离提取的方法。
- 微生物发酵法高效生产L‑色氨酸的方法-201610325135.4
- 曹华杰;刘帅;李静;岳贵龙;张孟涛 - 河南巨龙生物工程股份有限公司
- 2016-05-17 - 2017-05-10 - C12P13/22
- 本发明涉及微生物发酵法高效生产L‑色氨酸的工艺方法，包括以下步骤（1）、培养成熟的大肠埃希氏菌JLTrp菌种；（2）、发酵罐培养将成熟菌种接种至发酵罐内，在温度34‑36℃，pH采用补充液氨分段控制，0‑18h7.0‑7.2，18h‑放罐6.4‑6.8，溶氧分段控制，0‑18h10‑25%，18h‑放罐15‑40%，压力0.03‑0.08MPa，风量0.3VVM‑2.0VVM，过程中残糖控制0.01‑0.5%下培养制取L‑色氨酸本发明针对培养基成分及培养条件佳，并且对发酵过程残糖浓度控制、温度控制、pH 与溶解氧分段控制，使发酵周期缩短，发酵产量提高，工艺简单易控制，成本较低，适合大规模工业应用。
- 使用具有弱化的yjjK基因的表达的肠杆菌科细菌生产L‑氨基酸的方法-201410165915.8
- N.V.斯托伊诺瓦;V.V.萨姆索诺夫;N.S.厄雷米纳;E.A.波利亚科瓦 - 味之素株式会社
- 2014-04-23 - 2017-04-12 - C12P13/22
- 本发明涉及使用具有弱化的yjjK基因的表达的肠杆菌科细菌生产L‑氨基酸的方法。具体地，本发明提供通过利用肠杆菌科的细菌，尤其是属于埃希氏菌属的细菌发酵来产生L‑氨基酸的方法，所述细菌已经通过修饰而弱化了yjjK基因的表达。
- 一种制备左旋多巴的发酵方法-201611010592.0
- 金伟;郑长春;王博;白芳静;张勇;张兴灿;卢春玲;祈维蓉 - 山东鲁抗医药股份有限公司
- 2016-11-17 - 2017-01-11 - C12P13/22
- 本发明提供了一种制备左旋多巴的发酵方法，包括发酵培养大肠杆菌基因工程菌；在发酵培养至OD600＝25～30时，加入IPTG进行诱导所述大肠杆菌基因工程菌，并在转化液加入了氮气对转化菌体进行保护。本发明的方法采用了发酵加转化的方法来生产左旋多巴，使后续提取变得简单，大大降低了提取的成本，同时通过本发明诱导模式，使发酵液中的酶活较高。另一方面本发明对转化液进行充氮气保护，保证了底物邻苯二酚和产物左旋多巴不被氧化，保证了产品的质量和产量。
- 一种微生物发酵产苯丙氨酸的方法-201410277338.1
- 陈可泉;袁佩佩;何珣;曹伟佳;王震;肖文;赵艳;欧阳平凯 - 南京工业大学
- 2014-06-19 - 2016-11-30 - C12P13/22
- 本发明涉及一种高效、安全的微生物发酵生产L‑苯丙氨酸方法，属于生物工程技术领域。通过硫酸铵浓度和有机氮源种类优化，以及多阶段L‑酪氨酸指数补料方法，显著提高发酵液中L‑苯丙氨酸的浓度。L‑苯丙氨酸产量达到56 g/L左右。同时，硫酸铵、酵母粉和L‑酪氨酸用量较普通发酵方法相比明显减少，大大降低了L‑苯丙氨酸的生产成本。
- 一种L‑色氨酸的发酵工艺-201610712487.5
- 陈宁;徐庆阳;刘镇瑜;谢希贤;杨梦晨;张成林;李燕军;范晓光 - 天津科技大学
- 2016-08-24 - 2016-11-09 - C12P13/22
- 本发明提供了一种L‑色氨酸的发酵工艺，在L‑色氨酸发酵培养基中添加2g/L的棉籽饼粉进行发酵；发酵过程在乙酸产量大于5g/L时进行循环过滤，分离后的发酵清液进入提取工序；提取后的浓缩菌液进入发酵罐后补加透析培养基后继续发酵即得；所述发酵工艺发酵L‑色氨酸产酸周期延长20h，乙酸浓度维持在5g/L以下，单罐产量提高89％以上，转化率由17.0％提高至18.5％以上；由于发酵培养基中添加棉籽饼粉，未被菌体利用的棉籽壳粉在过滤中起到助滤作用，发酵液过滤速率由85mL/min提升至183mL/L。
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