[发明专利]一种利用多重荧光竞争性PCR检测拷贝数变异的方法

摘要

本发明利用多重荧光竞争性PCR对多个目标基因或位点进行拷贝数变异检测，以多重PCR取代人工合成或质粒构建进行内参文库构建。针对目标基因或位点和拷贝数确定的内参序列设计引物，区分序列以示区分，同时在特异引物的上下游5’端分别添加上下游通用序列。第一轮扩增构建文库后，将内参文库和检测文库混合，进行通用引物的第二轮扩增。利用检测文库和内参文库的目标基因或位点的荧光比值确定目标基因或位点的拷贝数。减少了竞争性PCR需要准确定量和稀释内参文库的过程，使多重荧光竞争性PCR替代了复杂的多重连接探针扩增。

主权项

1.一种利用多重荧光竞争性PCR针对多个目标基因或位点进行拷贝数变异检测的方法，包括如下步骤：(1)针对目标基因或位点、拷贝数确定的内参序列分别设计引物，使检测样本和内参样本的扩增引物仅上游特异引物具有区分序列的差异，下游特异引物完全一致，同时特异引物的5’端具有通用序列；(2)利用第一轮多重荧光竞争性PCR将内参样本和检测样本分别扩增2-20个循环获得内参文库和检测文库，将内参文库和检测文库混合并纯化，纯化产物作为第二轮扩增模板；(3)利用携带荧光的通用引物进行第二轮PCR扩增，产物进行毛细管电泳检测，通过电泳结果中检测文库和内参文库的相应目标基因或位点的荧光比值，并结合拷贝数确定的内参序列的比值计算出检测文库中目标基因或位点的拷贝数。