[发明专利]一种利用多重荧光竞争性PCR检测拷贝数变异的方法

说明书

本发明利用多重荧光竞争性PCR对多个目标基因或位点进行拷贝数变异检测，以多重PCR取代人工合成或质粒构建进行内参文库构建。针对目标基因或位点和拷贝数确定的内参序列设计引物，区分序列以示区分，同时在特异引物的上下游5’端分别添加上下游通用序列。第一轮扩增构建文库后，将内参文库和检测文库混合，进行通用引物的第二轮扩增。利用检测文库和内参文库的目标基因或位点的荧光比值确定目标基因或位点的拷贝数。减少了竞争性PCR需要准确定量和稀释内参文库的过程，使多重荧光竞争性PCR替代了复杂的多重连接探针扩增。

技术领域

本发明涉及核酸检测领域，特别是涉及一种利用多重荧光竞争性PCR针对多个样本的多个目标基因或位点进行拷贝数变异检测的方法。

背景技术

拷贝数变异(copy number variation，CNV)是一种与基因功能和人类疾病发生密切相关的遗传突变，因此CNV的研究具有重大的科研价值和临床意义。目前多种技术被应用于CNV检测，比如免疫荧光原位杂交、基于二代测序的CNV检测技术(CNV-seq)、基于基于芯片的比较基因组杂交(array-based comparative genomic hybridization，aCGH)、数字PCR、多重可扩增探针杂交(multiplex amplifiable probe hybridization，MAPH)、多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)和竞争性PCR。针对高通量的CNV检测，CNV-seq和aCGH是最佳的选择。但是针对大量样本的多个基因或位点，CNV-seq和aCGH由于成本问题难以适用。MLPA技术适合大量样本的多基因CNV检测，但实验优化过程、探针合成费用和非特异性杂交等问题影响了其大规模应用。基于高重复性、可操作性和低廉的价格，多重荧光竞争性PCR成为了检测大量样本的多基因或位点CNV的替代技术。多重荧光竞争性PCR检测CNV的关键点是将检测样本和拷贝数已知的内参样本共扩增，通过比较检测样本和内参样本区段之间荧光的比值，结合内参样本内区段的已知拷贝数，即可计算出检测样本区段的拷贝数。因此，多重荧光竞争性PCR检测CNV的限制主要集中在内参样本的构建和多重PCR中的非特异扩增。传统多重竞争性通过人工合成或者质粒构建完成内参样本的构建。构建完成的内参需要准确定量，并通过繁琐的稀释步骤，将内参浓度稀释到和检测样本同一个数量级。同时通过优化多重竞争性PCR反应条件和引物设计方案去减少非特异扩增，近些年有一些多重荧光竞争性PCR策略被报道，但仍待进一步提高。

发明内容

所要解决的技术问题

本发明所要解决的技术问题是提供一种利用多重荧光竞争性PCR检测CNV的方法，通过多重PCR方案取代传统的人工合成或质粒构建的方案进行内参文库构建，同时结合特异发夹引物克服传统多重PCR技术中非特异性扩增的问题。

技术方案

本发明的第一个方面是提供一种利用多重荧光竞争性PCR针对多个目标基因或位点进行拷贝数变异检测的方法，包括如下步骤：

(1)针对目标基因或位点、拷贝数确定的内参序列分别设计引物，使检测样本和内参样本的扩增引物仅上游特异引物具有区分序列的差异，下游特异引物完全一致，同时特异引物的5’端具有通用序列；

(2)利用第一轮多重荧光竞争性PCR将内参样本和检测样本分别扩增2-20个循环获得内参文库和检测文库，将内参文库和检测文库混合并纯化，纯化产物作为第二轮扩增模板；

(3)利用携带荧光的通用引物进行第二轮PCR扩增，产物进行毛细管电泳检测，通过电泳结果中检测文库和内参文库的相应目标基因或位点的荧光比值，并结合拷贝数确定的内参序列的比值计算出检测文库中目标基因或位点的拷贝数。

上述方法的优选方式之一为，所说的区分序列为额外添加在检测样本所有特异引物的5’端一段特异的短片段碱基序列。