[发明专利]一种利用多重荧光竞争性PCR检测拷贝数变异的方法

权利要求书

1.一种利用多重荧光竞争性PCR针对多个目标基因或位点进行拷贝数变异检测的试剂盒，包括目标基因或位点的引物、和内参序列的引物、以及荧光通用引物，所述试剂盒采用的检测方法包括如下步骤：

(1)针对目标基因或位点、拷贝数确定的内参序列分别设计引物，在设计的引物上下游5’端分别添加与目标区段3’末端部分序列完全互补配对序列，构成末端完全封闭发夹引物，使检测样本和内参样本的扩增引物仅上游特异引物具有区分序列的差异，下游特异引物完全一致，同时特异引物的5’端具有通用序列，利用通用序列设计携带荧光的通用引物；所说的通用序列包括在特异引物的上下游5’端分别添加的上游通用序列和下游通用序列；

(2)利用第一轮多重荧光竞争性PCR将内参样本和检测样本分别扩增2-20个循环获得内参文库和检测文库，将内参文库和检测文库混合并纯化，纯化产物作为第二轮扩增模板；

(3)利用携带荧光的通用引物进行第二轮PCR扩增，产物进行毛细管电泳检测，通过电泳结果中检测文库和内参文库的相应目标基因或位点的荧光比值，并结合拷贝数确定的内参序列的比值计算出检测文库中目标基因或位点的拷贝数。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所说的区分序列为额外添加在检测样本所有特异引物的5’端一段特异的短片段碱基序列。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所说的区分序列长度为4-16碱基。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所说的区分序列为ACTG。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所说的上游通用序列标记荧光。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的第一轮PCR中上下游特异引物数为2-38对。