[发明专利]一种鉴定砂梨品种抗黑斑病的SSR分子标记方法

摘要

本发明公开了一种鉴定砂梨品种抗黑斑病的SSR分子标记方法，其方法步骤为：A、利用梨黑斑病菌株对高抗黑斑病梨品种和高感黑斑病梨品种的叶片进行室内接种，以喷雾无菌水作为对照，提取RNA；B、上机测序混合RNA样品制备；C、测序序列组装及差异表达基因分析；D、抗黑斑病紧密相关基因的筛选；E、抗黑斑病紧密相关SSR位点筛选；F、砂梨抗黑斑病紧密相关的SSR分子标记筛选。使用本方法筛选的鉴定砂梨品种抗黑斑病的SSR分子标记可以为砂梨抗黑斑病分子育种和抗黑斑病机理的研究奠定理论基础。

主权项

一种鉴定砂梨品种抗黑斑病的SSR分子标记方法，其特征在于，包括如下步骤：A、梨黑斑病接种利用梨黑斑病菌株对高抗黑斑病梨品种“金晶梨”和高感黑斑病梨品种“红粉梨”的叶片进行室内接种，以喷雾无菌水作为对照； 接种后分别在0天，1天，2天，3天和4天进行取样，提取RNA；B、上机测序RNA样品制备每个处理样品的RNA使用TRIzol方法进行提取，RNA的纯度检测使用Nanodrop分光光度计进行检测； 先将每个处理样品的RNA浓度都稀释到750ng/μl，然后将0天，1天，2天，3天和4天的RNA分别取40μl混合成200μlRNA混合液，得到四个处理的RNA样品； 用带有Oligo的磁珠富集真核生物的mRNA；加入fragmentation buffer将mRNA打断成短片段，以mRNA为模版，用random hexamers合成第一条cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成第二条cDNA链，在经过QiaQuick PCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱之后做末端修复、3’加polyA并连接测序接头，然后用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，最后进行PCR扩增，建好的文库用Illumina HiSeqTM 2000进行测序；C、测序序列组装及差异表达基因分析利用已发表梨基因组作为参照基因组，使用快速拼接程序Bowtie对测序片段进行组装，原始的基因表达数据使用RPKM进行标准化计算；为了比较处理与对照样品的差异基因，筛选差异显著性P‑value<0.005、错误率FDR≤0.01且倍数差异在2倍以上的做为差异表达基因（DEGs）；D、抗黑斑病紧密相关基因的筛选使用EBSeq软件检测4个样品中的差异表达基因（DEGs）；“红粉梨”接种菌株与“红粉梨”接种清水样品比较获得差异表达基因，“金晶梨”接种菌株与“金晶梨”接种清水样品比较获得差异表达基因；比较来自“红粉梨”与来自“金晶梨”之间的差异表达基因，获得了抗黑斑病紧密相关基因DEGs；E、抗黑斑病紧密相关SSR位点筛选基于上述筛选的抗黑斑病紧密相关基因DEGs，利用MIcroSAtellite (MISA)软件筛选出SSR位点；F、砂梨抗黑斑病紧密相关的SSR分子标记筛选基于上述SSR位点，利用引物设计软件Primer3进行引物设计，每个SSR位点设计2对引物；然后利用设计的SSR引物对“红粉梨”和“金晶梨”的DNA进行扩增，筛选出引物能够区分高抗黑斑病梨品种“金晶梨”和高感黑斑病梨品种“红粉梨”。