[发明专利]一种鉴定砂梨品种抗黑斑病的SSR分子标记方法

说明书

技术领域

本发明属于果树分子遗传育种技术领域，提供了一种鉴定砂梨品种抗黑斑病的SSR分子标记方法，可用于砂梨品种抗黑斑病早期鉴定和砂梨抗黑斑病育种，以提高砂梨抗病育种效率，适用于从事梨科研、育种及生产的科研单位和公司。

背景技术

梨是世界上重要的水果之一，它已经在世界范围内50个国家进行很长时间的商业化栽培。但梨树病害是制约梨产业发展的一个重要因素。由互隔交链孢菌（Alternairiaalternata）引起的梨黑斑病是砂梨重要的病害之一。梨黑斑病主要危害梨树叶片、果实和新梢。叶部受害，幼叶先发病、褐色或黑褐色圆形斑点，后逐渐扩大，形成近圆形或不规则形病斑，病叶即焦枯、畸形，引起早期脱落。果实受害，果面出现一个至数个黑色斑点，逐渐扩大，颜色变浅，形成浅褐至灰褐色圆形病斑，略凹陷。发病后期病果畸形、龟裂，裂缝可深达果心，果面和裂缝内产生黑霉，并常常引起落果。果实近成熟期染病，前期表现与幼果相似，但病斑较大，黑褐色，后期果肉软腐而脱落。梨黑斑病的潜伏侵染能够引起梨果在贮藏期的腐烂，因此在梨的进出口贸易中受到进口国的严密关注。

梨黑斑病防治不当造成梨树叶片提前脱落，容易使梨树形成二次花，严重影响次年梨果产量，给梨农造成严重的经济损失。目前防治梨黑斑病的方法是使用甲基托布津、代森锰锌和苯醚甲环唑等化学药剂，长期使用这些化学药剂，必然会引起病原菌对化学药剂产生抗药性、污染环境和对人体健康产生危害等问题。

植物抗病育种是一种有效经济的防治病害的手段，由于梨树的童期长，遗传背景复杂等造成传统的抗病育种效率较低，而采用分子育种则可以避开童期的干扰，向现有栽培品种引入抗病基因（R-gene）的同时，不会形成基因的大规模重组。抗病基因在分析植物抗病机理中具有重要作用，一大批的抗病基因在水稻、小麦、大豆、苹果和葡萄等植物中被分离出来。近年来梨科研工作者已经从梨中分离出梨火疫病、疮痂病等抗病相关的抗病基因，但目前还没有梨黑斑病相关的抗病基因被分离克隆出来。转录组测序分析能够在基因表达水平反映植物在生长发育或由外界环境诱导所产生的变化，最新的双末端测序技术能够提高DNA的测序效率和提高测序片段的长度，提供更好的转录组分析。基因水平的表达、基因表达的功能注释、新基因的挖掘、SSR筛选和SNP的发现等转录组信息利用生物信息学手段进行研究，以便更好深入了解生物进程。这些信息有助于预测单个基因的作用，也能阐述更为复杂的信号途径和揭示潜在的网络关系。

多年来，我们一直围绕确定鉴定砂梨品种抗黑斑病的SSR分子标记的分离工作进行研究，利用转录组测序技术，通过对抗梨黑斑病种质和感梨黑斑病的种质的接种后的差异表达基因的分析，筛选鉴定砂梨品种抗梨黑斑病的SSR分子标记。本研究为砂梨品种抗黑斑病早期鉴定和砂梨抗黑斑病分子育种奠定理论基础。

发明内容

本发明的目的是针对梨树的童期长，遗传背景复杂等造成传统的抗病育种效率较低的问题，提供鉴定砂梨品种抗梨黑斑病的SSR分子标记分子标记，以提高砂梨品种抗黑斑病早期鉴定和砂梨抗黑斑病育种的效率。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

本发明是通过对高抗黑斑病梨品种“金晶梨”和高感黑斑病梨品种“红粉梨”离体叶片接种病原和无菌水后进行转录组测序分析，获取响应病菌诱导和品种之间的差异表达基因，再通过差异基因的基因序列，筛选SSR位点，并根据SSR位点序列设计SSR引物，通过对抗病梨品种“金晶梨”和感病品种“红粉梨”的PCR扩增来确定鉴定砂梨品种抗梨黑斑病的SSR分子标记。

1.一种鉴定砂梨品种抗黑斑病的SSR分子标记，其特征在于，包括如下步骤：

A、梨黑斑病接种

利用梨黑斑病菌株对高抗黑斑病梨品种“金晶梨”和高感黑斑病梨品种“红粉梨”的叶片进行室内接种，以喷雾无菌水作为对照；接种后分别在0天，1天，2天，3天和4天进行取样，提取RNA；

B、上机测序RNA样品制备

每个处理样品的RNA使用TRIzol方法进行提取，RNA的纯度检测使用Nanodrop分光光度计进行检测；先将每个处理样品的RNA浓度都稀释到750ng/μl，然后将0天，1天，2天，3天和4天的RNA分别取40μl混合成200μlRNA混合液，得到四个处理的RNA样品；用带有Oligo的磁珠富集真核生物的mRNA；