[发明专利]一种利用基因工程培育高异黄酮抗草甘膦大豆的方法

摘要

本发明公开一种利用基因工程培育高异黄酮抗草甘膦大豆的方法，包括以下步骤：步骤一、克隆TpIFS基因片段；步骤二、克隆EPSPS基因片段；步骤三、共转化TpIFS基因片段和EPSPS基因片段到大豆中，得到高异黄酮抗草甘膦大豆；该TpIFS基因片段是异黄酮合成酶基因片段，来自红三叶；该EPSPS基因片段是5‑烯醇丙酮酰莽草酸‑3‑磷酸合成酶基因片段。在非转化对照大豆中异黄酮含量为5.1mg/g干重时，本发明得到的基因工程大豆植株中成熟籽粒异黄酮含量最高14.18mg/g干重，其含量是非转化对照大豆含量的2.78倍。本发明的方法对于提高大豆异黄酮含量具有重要意义。

主权项

1.一种利用基因工程培育高异黄酮抗草甘膦大豆的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、克隆TpIFS基因片段；步骤二、克隆EPSPS基因片段；步骤三、共转化TpIFS基因片段和EPSPS基因片段到大豆中，得到高异黄酮抗草甘膦大豆；其中，所述TpIFS基因片段是异黄酮合成酶基因片段，所述TpIFS基因片段来自红三叶(Trifolium pratense)，所述EPSPS基因片段是5‑烯醇丙酮酰莽草酸‑3‑磷酸合成酶基因片段；所述步骤一具体为：PCR扩增、回收得到所述TpIFS基因片段，将所述TpIFS基因片段与pMD18‑T载体连接，将连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，酶切及PCR鉴定后将阳性克隆测序，确定得到包含TpIFS基因片段的重组子pTpIFS；所述步骤二具体为：PCR扩增、回收得到所述EPSPS基因片段，将所述EPSPS基因片段与pMD18‑T载体连接，将连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，酶切及PCR鉴定后将阳性克隆测序，确定得到包含EPSPS基因片段的重组子pEPSPS；所述步骤三具体为：利用所述步骤一中的重组子pTpIFS和所述步骤二中的重组子pEPSPS构建重组质粒pCAMBIA‑TpIFS‑EPSPS，并利用所述重组质粒pCAMBIA‑TpIFS‑EPSPS将其含有的TpIFS基因片段和EPSPS基因片段共转化到大豆中，得到所述高异黄酮抗草甘膦大豆；所述步骤三中采用冷激的方法将同时包含TpIFS基因片段和EPSPS基因片段的重组质粒导入根癌农杆菌，然后采用农杆菌介导法将所述根癌农杆菌导入大豆，得到所述高异黄酮抗草甘膦大豆。