[发明专利]一种酵母菌富集铜离子的驯化培养和检测方法

摘要

本发明涉及一种酵母菌富集铜离子的驯化培养和检测方法；驯化培养方法为首先配制不同铜离子浓度驯化培养基和基础培养基；将所培养的产朊假丝酵母种子液，接种到不同铜离子浓度驯化培养基中，摇床培养；选择所培养的菌液中OD600值高，上清液中铜离子的含量较低的产朊假丝酵母菌作为出发菌种；取出发菌种菌液，接种到最低含铜离子的浓度为的驯化培养基中，摇瓶培养后，再吸取菌液接种到浓度为次低的驯化培养基中，按照此方法，接种培养；最后检测不同代次产朊假丝酵母的铜离子转化率，当铜离子的转化率不变或降低时，该菌种即为富铜酵母生产菌种。本发明所培养的酵母菌可在高铜离子浓度培养基中生长，对铜离子的转化效率高，为酵母新功能开发提供基础。

主权项

1.一种酵母菌富集铜离子的驯化培养方法，其特征在于：包括以下步骤：（ 1 ）、驯化培养基的配制：每1000mL蒸馏水中加入玉米浆40g，糖蜜20g，葡萄糖5g，硝酸铵2g，硫酸镁0.2g和磷酸二氢钾0.5g，搅拌至完全溶解后用盐酸或氨水调节pH值为5.0，将所得混合溶液分为10份，分别添加硫酸铜调整混合溶液中铜离子的浓度分别为：0.156 μmol/mL、0.313μmol/mL、0.469μmol/mL、0.625μmol/mL、0.781μmol/mL、1.563μmol/mL、2.344μmol/mL、3.125μmol/mL、3.906μmol/mL和4.688μmol/mL，得到十种不同铜离子浓度的筛选培养基，分别装入10个三角瓶中，装液量为三角瓶体积的20%，进行高压蒸汽灭菌后，备用；基础液体培养基的配制：每1000mL蒸馏水中加入蛋白胨20g，酵母膏10g，葡萄糖20g，搅拌至完全溶解后用盐酸或氨水调节pH值为5.0，备用；（2）、产朊假丝酵母培养：挑取2‑3接种环活化后的产朊假丝酵母斜面菌种，接种到装有基础培养基的试管中，30℃下，220rpm摇床培养至菌液的OD600值为1.0，得到产朊假丝酵母种子液，备用；（3）、将产朊假丝酵母种子液分别接种到上述步骤（1）所制备10个装有不同铜离子浓度的驯化培养基的三角瓶中；将接种后的10个三角瓶置于30℃下，220rpm，摇床培养14h，得到产朊假丝酵母菌液；检测上述步骤（3）中所培养的产朊假丝酵母菌液其OD600值，并通过离心测定产朊假丝酵母菌液的上清液中铜离子的量；（4）、选择上述步骤（3）中所培养的产朊假丝酵母菌其菌液OD600值最高，且其菌液中铜离子的含量最低的产朊假丝酵母菌，作为出发菌种；取上述步骤（3）所培养的该出发菌种的菌液1mL，接种到铜离子的浓度为0.781μmol/mL的50mL驯化培养基中，30℃下，摇瓶培养14h后，吸取1mL菌液接种到铜离子的浓度为1.563μmol/mL的50mL驯化培养基中，30℃下，摇瓶培养14h, 吸取1mL菌液接种到铜离子的浓度为2.344μmol/mL的驯化培养基中，30℃下，摇瓶培养14h, 再次吸取1mL菌液，接种到铜离子的浓度为3.125μmol/mL的驯化培养基中，30℃下，摇瓶培养14h, 再次吸取1mL菌液，接种到铜离子的浓度为3.906μmol/mL的驯化培养基中，30℃下，摇瓶培养14h, 再次吸取1mL菌液，接种到铜离子的浓度为4.688μmol/mL的驯化培养基中，30℃下，摇瓶培养14h；在培养过程中，所培养的菌液除接种外所剩余菌液均存放于冰箱中，备用；（5）、将上述步骤（4）冰箱中所保存的菌液取出，分别检测不同代次产朊假丝酵母的铜离子转化率，当铜离子的转化率不变或降低时，认为达到该菌种对铜离子的最大耐受能力；保留此菌种作为富铜酵母生产菌种，以此时的培养基配方作为生产富铜酵母的最佳培养基配方。