[发明专利]一种酵母菌富集铜离子的驯化培养和检测方法

权利要求书

1.一种酵母菌富集铜离子的驯化培养方法，其特征在于：包括以下步骤：

（ 1 ）、驯化培养基的配制：每1000mL蒸馏水中加入玉米浆40g，糖蜜20g，葡萄糖5g，硝酸铵2g，硫酸镁0.2g和磷酸二氢钾0.5g，搅拌至完全溶解后用盐酸或氨水调节pH值为5.0，将所得混合溶液分为10份，分别添加硫酸铜调整混合溶液中铜离子的浓度分别为：0.156 μmol/mL、0.313μmol/mL、0.469μmol/mL、0.625μmol/mL、0.781μmol/mL、1.563μmol/mL、2.344μmol/mL、3.125μmol/mL、3.906μmol/mL和4.688μmol/mL，得到十种不同铜离子浓度的筛选培养基，分别装入10个三角瓶中，装液量为三角瓶体积的20%，进行高压蒸汽灭菌后，备用；

基础液体培养基的配制：每1000mL蒸馏水中加入蛋白胨20g，酵母膏10g，葡萄糖20g，搅拌至完全溶解后用盐酸或氨水调节pH值为5.0，备用；

（2）、产朊假丝酵母培养：挑取2-3接种环活化后的产朊假丝酵母斜面菌种，接种到装有基础培养基的试管中，30℃下，220rpm摇床培养至菌液的OD600值为1.0，得到产朊假丝酵母种子液，备用；

（3）、将产朊假丝酵母种子液分别接种到上述步骤（1）所制备10个装有不同铜离子浓度的驯化培养基的三角瓶中；将接种后的10个三角瓶置于30℃下，220rpm，摇床培养14h，得到产朊假丝酵母菌液；检测上述步骤（3）中所培养的产朊假丝酵母菌液其OD600值，并通过离心测定产朊假丝酵母菌液的上清液中铜离子的量；

（4）、选择上述步骤（3）中所培养的产朊假丝酵母菌其菌液OD600值最高，且其菌液中铜离子的含量最低的产朊假丝酵母菌，作为出发菌种；取上述步骤（3）所培养的该出发菌种的菌液1mL，接种到铜离子的浓度为0.781μmol/mL的50mL驯化培养基中，30℃下，摇瓶培养14h后，吸取1mL菌液接种到铜离子的浓度为1.563μmol/mL的50mL驯化培养基中，30℃下，摇瓶培养14h, 吸取1mL菌液接种到铜离子的浓度为2.344μmol/mL的驯化培养基中，30℃下，摇瓶培养14h, 再次吸取1mL菌液，接种到铜离子的浓度为3.125μmol/mL的驯化培养基中，30℃下，摇瓶培养14h, 再次吸取1mL菌液，接种到铜离子的浓度为3.906μmol/mL的驯化培养基中，30℃下，摇瓶培养14h, 再次吸取1mL菌液，接种到铜离子的浓度为4.688μmol/mL的驯化培养基中，30℃下，摇瓶培养14h；在培养过程中，所培养的菌液除接种外所剩余菌液均存放于冰箱中，备用；

（5）、将上述步骤（4）冰箱中所保存的菌液取出，分别检测不同代次产朊假丝酵母的铜离子转化率，当铜离子的转化率不变或降低时，认为达到该菌种对铜离子的最大耐受能力；保留此菌种作为富铜酵母生产菌种，以此时的培养基配方作为生产富铜酵母的最佳培养基配方。

2.如权利要求1所述的一种酵母菌富集铜离子的驯化培养方法，其特征在于：步骤(2)中所述装有基础培养基的试管的装液量为试管体积的25%。

3.如权利要求1所述的一种酵母菌富集铜离子的驯化培养方法，其特征在于：步骤(5)中所述检测不同代次产朊假丝酵母的铜离子转化率的方法为：

（1）、称取恒重的硫酸铜配制成铜离子浓度为0.156μmol/mL的铜离子标准液，用移液枪依次吸取0.50mL、1.00mL、1.50mL、2.00mL和2.50mL铜离子标准液，分别移入5个体积为125mL的分液漏斗中；另外取1个不添加铜离子标准液的分液漏斗，即空白对照；然后分别在6个分液漏斗中添加硫酸至分液漏斗中的溶液体积为20mL；然后，分别向6个分液漏斗中依次加入5mL柠檬酸铵和乙二胺四乙酸二钠的混合水溶液、3滴酚红试剂，摇匀后，采用氨水将分液漏斗中的溶液调至红色，其中柠檬酸铵和乙二胺四乙酸二钠的混合水溶液的制备方法为称取20g柠檬酸铵和5 g乙二胺四乙酸二钠溶于水中，并用水定容至100 mL；接着，再分别加入2mL二乙基二硫代氨基甲酸钠水溶液和10mL四氯化碳溶液，剧烈振摇2min，静置等分层后，分别用脱脂棉将四氯化碳层滤入2cm比色杯中；采用四氯化碳调节零点，在波长为440nm处测铜标准溶液的吸光度，用铜标准溶液各点吸光值减去空白对照管吸光值后，在软件中绘制标准曲线并计算回归方程；

（2）、取1ml冰箱中所保存的待检测菌液加入到离心管中，放入3000r/min的离心机中离心2min，取上清液分别置于250mL具塞锥形瓶中，加入100mL盐酸，充分摇匀后，转入250mL容量瓶中，加水定容至250mL；吸取5mL容量瓶中溶液置于体积为125mL的分液漏斗中，然后加入15mL水稀释至20mL；按照铜离子标准曲线的方法进行测其在波长为440nm的吸光度，将吸光度结果带入回归方程计算铜离子浓度。