[发明专利]一种重组细菌素及其制备方法和应用

摘要

本发明涉及一种重组细菌素及其制备方法和应用，属于生物技术领域。本发明重组细菌素LacAB基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述重组表达载体pGEX‑4T‑1‑LacAB包含SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。本发明将含有重组表达载体pGEX‑4T‑1‑LacAB的大肠杆菌BL21经IPTG诱导目的蛋白表达，收集菌液，提取菌液中的重组蛋白，得到的重组蛋白溶液通过GST纯化柱，GST标签和柱子上的GST亲和蛋白结合，通过洗脱液得到纯化的GST‑LacAB蛋白，用凝血酶切除GST标签后，用GST纯化试剂盒纯化，得到单一的重组细菌素LacAB。本发明的重组细菌素抗菌活性及稳定性好，抑菌谱广，可作为理想的抗生素替代品和人畜生物性药物、饲料添加剂、防腐剂、消杀剂等。 1

主权项

1.一种重组细菌素LacAB基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种重组表达载体pGEX‑4T‑1‑LacAB，其特征在于，它包含权利要求1所述的核苷酸序列。

3.构建权利要求2所述重组表达载体pGEX‑4T‑1‑LacAB的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)以干酪乳杆菌基因组DNA为模板，设计特异性引物扩增得到ClassIIb细菌素基因的两段片段，分别为ClassIIb‑LacA片段和ClassIIb‑LacB片段；

(2)根据步骤(1)获得的细菌素基因ClassIIb‑LacA序列和ClassIIb‑LacB序列，设计带有酶切位点的特异引物采用重叠PCR方法扩增LacAB重组基因序列，扩增得到的LacAB基因产物与同样酶切的pMD18‑T载体连接；

(3)连接产物转化大肠杆菌感受态细胞E.coli TOP10，菌落PCR鉴定阳性克隆，阳性克隆经酶切验证和测序，得到pMD18‑T‑LacAB重组克隆载体；

(4)将pMD18‑T‑LacAB重组克隆载体与表达载体pGEX‑4T‑1用EcoRⅠ和SalⅠ限制性内切酶双酶切，pMD18‑T‑LacAB重组克隆载体的酶切产物LacAB克隆到pGEX‑4T‑1载体上，构建重组表达载体pGEX‑4T‑1‑LacAB，重组表达载体转化大肠杆菌感受态细胞E.coli TOP10，菌落PCR鉴定阳性克隆，阳性克隆经酶切验证和测序，得到pGEX‑4T‑1‑LacAB重组表达载体。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)中扩增LacA片段的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示；扩增LacB片段的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示；所述酶切产物LacAB与pGEX‑4T‑1载体按照摩尔比3:1进行混合，16℃金属浴过夜连接。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)中扩增LacA片段的特异性引物P1/P2的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示；扩增LacB片段的特异性引物P3/P4的核苷酸序列如SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示，且LacA下游引物P2的3’端与LacB的上游引物P3的5’端有15个碱基互补配对；所述重叠PCR方法的具体步骤：第一步，分别以P1/P2、P3/P4为引物，ClassIIb‑LacA基因和ClassIIb‑LacB基因为模板，进行PCR扩增获得彼此互补配对的粘性末端的LacA和LacB；第二步，以P1/P4为引物，LacA/LacB模板，进行PCR扩增，获得重组细菌素基因LacAB。

6.含有权利要求2所述的重组表达载体pGEX‑4T‑1‑LacAB的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌TOP10，DH5α和BL21。

7.一种制备重组细菌素LacAB的方法，其特征在于，将权利要求6所述大肠杆菌BL21经IPTG诱导目的蛋白表达，收集菌液，提取菌液中的重组蛋白，得到的重组蛋白溶液通过GST纯化柱，GST标签和柱子上的GST亲和蛋白结合，通过洗脱液得到纯化的GST‑LacAB蛋白，用凝血酶切除GST标签后，用GST纯化试剂盒纯化，得到单一的重组细菌素LacAB。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

(1)pGEX‑4T‑1‑LacAB重组表达载体的诱导表达

将权利要求6所述大肠杆菌BL21于含100mg/L Amp的LB培养基中过夜培养后，按照1:50V/V的比例转接到含100mg/L Amp的LB液体培养基中，以200rpm转速培养2～3h，菌液OD600达到0.6～1.0时，按浓度0.2～1.2mmol/L加入IPTG诱导1～5h，5000rpm离心10min，获得菌体培养物；

(2)重组蛋白的提取

在收集的菌体中加入细菌裂解液；4℃裂解10min，12000rpm离心5min，取上清液，上清液与2×SDS PAGE loading buffer 1:1混合；用漩涡器剧烈振荡，确保将管底沉淀振散，将样品于100℃恒温加热器上开盖加热10min；样品凉后，12000r/min离心3min，样品‑80℃保存待用或直接上样；

所述细菌裂解液含有pH8.5～9.0的50mMTris‑HCl，2mMEDTA，100mMNaCl，0.5％TritonX‑100，1mg/mL溶菌酶；

(3)重组蛋白的纯化

将样品与GSH‑Sepharose 4B悬液混合，室温作用10min，GST标签和柱子上的GST亲和蛋白结合，收集洗脱液，得到纯化的GST‑LacAB蛋白；

(4)重组蛋白的酶切

按100ug的GST‑LacAB蛋白加入1单位的凝血酶常温反应16h，使酶切程度达到90％以上；

(5)目的蛋白的纯化

重组融合蛋白被凝血酶切割后，用GST纯化试剂盒纯化，得到单一的重组细菌素LacAB。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，IPTG诱导表达条件为：诱导温度为30℃、IPTG浓度为0.8mmol/L，诱导表达时间为3h，最佳表达菌株为感受态大肠杆菌BL21表达菌株。

10.权利要求7‑9任一项所述方法制备得到的重组细菌素LacAB在制备抗菌药物、抗病毒药物、饲料添加剂、防腐剂或消杀剂中的应用。