[发明专利]一种重组细菌素及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种重组细菌素LacAB基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种重组表达载体pGEX-4T-1-LacAB，其特征在于，它包含权利要求1所述的核苷酸序列。

3.构建权利要求2所述重组表达载体pGEX-4T-1-LacAB的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)以干酪乳杆菌基因组DNA为模板，设计特异性引物扩增得到ClassIIb细菌素基因的两段片段，分别为ClassIIb-LacA片段和ClassIIb-LacB片段；

(2)根据步骤(1)获得的细菌素基因ClassIIb-LacA序列和ClassIIb-LacB序列，设计带有酶切位点的特异引物采用重叠PCR方法扩增LacAB重组基因序列，扩增得到的LacAB基因产物与同样酶切的pMD18-T载体连接；

(3)连接产物转化大肠杆菌感受态细胞E.coli TOP10，菌落PCR鉴定阳性克隆，阳性克隆经酶切验证和测序，得到pMD18-T-LacAB重组克隆载体；

(4)将pMD18-T-LacAB重组克隆载体与表达载体pGEX-4T-1用EcoRⅠ和SalⅠ限制性内切酶双酶切，pMD18-T-LacAB重组克隆载体的酶切产物LacAB克隆到pGEX-4T-1载体上，构建重组表达载体pGEX-4T-1-LacAB，重组表达载体转化大肠杆菌感受态细胞E.coli TOP10，菌落PCR鉴定阳性克隆，阳性克隆经酶切验证和测序，得到pGEX-4T-1-LacAB重组表达载体。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)中扩增LacA片段的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示；扩增LacB片段的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示；所述酶切产物LacAB与pGEX-4T-1载体按照摩尔比3:1进行混合，16℃金属浴过夜连接。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)中扩增LacA片段的特异性引物P1/P2的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示；扩增LacB片段的特异性引物P3/P4的核苷酸序列如SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示，且LacA下游引物P2的3’端与LacB的上游引物P3的5’端有15个碱基互补配对；所述重叠PCR方法的具体步骤：第一步，分别以P1/P2、P3/P4为引物，ClassIIb-LacA基因和ClassIIb-LacB基因为模板，进行PCR扩增获得彼此互补配对的粘性末端的LacA和LacB；第二步，以P1/P4为引物，LacA/LacB模板，进行PCR扩增，获得重组细菌素基因LacAB。

6.含有权利要求2所述的重组表达载体pGEX-4T-1-LacAB的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌TOP10，DH5α和BL21。

7.一种制备重组细菌素LacAB的方法，其特征在于，将权利要求6所述大肠杆菌BL21经IPTG诱导目的蛋白表达，收集菌液，提取菌液中的重组蛋白，得到的重组蛋白溶液通过GST纯化柱，GST标签和柱子上的GST亲和蛋白结合，通过洗脱液得到纯化的GST-LacAB蛋白，用凝血酶切除GST标签后，用GST纯化试剂盒纯化，得到单一的重组细菌素LacAB。