[发明专利]未知序列的双股线性核酸的全长扩增方法

摘要

本发明揭露了一种用以扩增样本中未知序列的所有线性、双股核酸分子的转接子(adaptor)。该转接子包含(1)第一个寡核苷酸(称为P‑oligo):在5’端带有磷酸，且在3’端不带有额外的T(胸腺嘧啶)核苷酸(nucleotide)；以及(2)第二个寡核苷酸(称为T‑oligo):3’端带有额外的T，但5’端不带有磷酸。除了在该T‑oligo内的3’‑T之处，P‑oligo与T‑oligo在序列上互补，所以可以形成双股的转接子。该转接子与未知序列的核酸(即目标核酸)中3’端上额外的腺嘌呤(3’‑A)接合，形成”转接子‑目标核酸”的结构。该T‑oligo接着被作为用于T oligo‑引发的聚合酶链式反应(T oligo‑primed polymerase chain reaction，TOP‑PCR)的唯一引物(primer)，藉以扩增整段未知序列的核酸分子。

主权项

1.一种扩增未知序列的线性、双股核酸的方法，其包含以下步骤：/n(a)提供该未知序列的线性、双股的目标核酸；/n(b)将一腺嘌呤核苷酸(A)加至该未知序列的线性、双股的目标核酸的3’-尾端，以获得带有3’-腺嘌呤核苷酸(3’-A)突出端的未知序列的线性、双股的目标核酸；/n(c)提供带有5’-磷酸(5’-p)的第一股寡核苷酸；/n(d)提供带有3’-胸腺嘧啶核苷酸(3’-T)但不带有5’-磷酸(5’-p)的第二股寡核苷酸，该带有3’-胸腺嘧啶核苷酸(3’-T)但不带有5’-磷酸(5’-p)的第二股寡核苷酸与该带有5’-磷酸(5’-p)的第一股寡核苷酸在除了该带有3’-胸腺嘧啶核苷酸(3’-T)但不带有5’-磷酸(5’-p)的第二股寡核苷酸的3’-胸腺嘧啶核苷酸(3’-T)以外之处互补，且除了其3’-胸腺嘧啶核苷酸(3’-T)之外，该带有3’-胸腺嘧啶核苷酸(3’-T)但不带有5’-磷酸(5’-p)的第二股寡核苷酸的长度比该带有5’-磷酸(5’-p)的第一股寡核苷酸的长度短或相同；/n(e)使该带有5’-磷酸(5’-p)的第一股寡核苷酸与该带有3’-胸腺嘧啶核苷酸(3’-T)但不带有5’-磷酸(5’-p)的第二股寡核苷酸退火，以产生带有3’-T突出端的同类转接子；/n(f)将该同类转接子接合至该带有3’-腺嘌呤核苷酸(3’-A)突出端的未知序列的线性、双股的目标核酸上，以形成“同类转接子-未知序列的线性、双股的目标核酸”的结构，使之带有贴附于其上每一端的同类转接子；以及/n(g)执行聚合酶链式反应，以该“同类转接子-未知序列的线性、双股的目标核酸”作为模板，且以该带有3’-胸腺嘧啶核苷酸(3’-T)但不带有5’-磷酸(5’-p)的第二股寡核苷酸作为单一引物，以获得聚合酶链式反应产物，其中该未知序列的线性、双股的目标核酸的全长被扩增。/n