[发明专利]未知序列的双股线性核酸的全长扩增方法

权利要求书

1.一种扩增未知序列的线性、双股核酸的方法，其包含以下步骤：

(a)提供该未知序列的线性、双股的目标核酸；

(b)将一腺嘌呤核苷酸(A)加至该未知序列的线性、双股的目标核酸的3’-尾端，以获得带有3’-腺嘌呤核苷酸(3’-A)突出端的未知序列的线性、双股的目标核酸；

(c)提供带有5’-磷酸(5’-p)的第一股寡核苷酸；

(d)提供带有3’-胸腺嘧啶核苷酸(3’-T)但不带有5’-磷酸(5’-p)的第二股寡核苷酸，该带有3’-胸腺嘧啶核苷酸(3’-T)但不带有5’-磷酸(5’-p)的第二股寡核苷酸与该带有5’-磷酸(5’-p)的第一股寡核苷酸在除了该带有3’-胸腺嘧啶核苷酸(3’-T)但不带有5’-磷酸(5’-p)的第二股寡核苷酸的3’-胸腺嘧啶核苷酸(3’-T)以外之处互补，且除了其3’-胸腺嘧啶核苷酸(3’-T)之外，该带有3’-胸腺嘧啶核苷酸(3’-T)但不带有5’-磷酸(5’-p)的第二股寡核苷酸的长度比该带有5’-磷酸(5’-p)的第一股寡核苷酸的长度短或相同；

(e)使该带有5’-磷酸(5’-p)的第一股寡核苷酸与该带有3’-胸腺嘧啶核苷酸(3’-T)但不带有5’-磷酸(5’-p)的第二股寡核苷酸退火，以产生带有3’-T突出端的同类转接子；

(f)将该同类转接子接合至该带有3’-腺嘌呤核苷酸(3’-A)突出端的未知序列的线性、双股的目标核酸上，以形成“同类转接子-未知序列的线性、双股的目标核酸”的结构，使之带有贴附于其上每一端的同类转接子；以及

(g)执行聚合酶链式反应，以该“同类转接子-未知序列的线性、双股的目标核酸”作为模板，且以该带有3’-胸腺嘧啶核苷酸(3’-T)但不带有5’-磷酸(5’-p)的第二股寡核苷酸作为单一引物，以获得聚合酶链式反应产物，其中该未知序列的线性、双股的目标核酸的全长被扩增。

2.如权利要求1所述的方法，其中该同类转接子只涉及一次的连接步骤。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中该同类转接子不会自我接合。

4.如权利要求1或2所述的方法，其中该未知序列的线性、双股的目标核酸为体液DNA。

5.如权利要求1所述的方法，其中该同类转接子具有3’-胸腺嘧啶核苷酸(3’-T)突出端与3’-非腺嘌呤核苷酸(3’-非A)突出端。

6.如权利要求1所述的方法，其中该同类转接子具有3’-突出端与平端。

7.如权利要求4所述的方法，其中该体液选自血液、唾液、精液、阴道分泌物，以及羊水。

8.如权利要求1所述的方法，其中该未知序列的线性、双股的目标核酸的含量为不大于20个拷贝数。

9.如权利要求8所述的方法，其中该未知序列的线性、双股的目标核酸的含量为不大于10个拷贝数。

10.如权利要求1所述的方法，其中该未知序列的线性、双股的目标核酸的含量为不大于5皮克。

11.如权利要求10所述的方法，其中该未知序列的线性、双股的目标核酸的含量为不大于0.01皮克。

12.如权利要求1所述的方法，其中“该同类转接子-未知序列的线性、双股的目标核酸”的结构不会环状化或形成环形核酸。

13.如权利要求1所述的方法，其中该聚合酶链式反应是在异类引物不存在下进行的。

14.如权利要求1所述的方法，其中该同类转接子与该带有3’-腺嘌呤核苷酸(3’-A)突出端的未知序列的线性、双股的目标核酸的接合步骤是在异类转接子不存在下进行的。