[发明专利]未知序列的双股线性核酸的全长扩增方法

说明书

本发明揭露了一种用以扩增样本中未知序列的所有线性、双股核酸分子的转接子(adaptor)。该转接子包含(1)第一个寡核苷酸(称为P‑oligo):在5’端带有磷酸，且在3’端不带有额外的T(胸腺嘧啶)核苷酸(nucleotide)；以及(2)第二个寡核苷酸(称为T‑oligo):3’端带有额外的T，但5’端不带有磷酸。除了在该T‑oligo内的3’‑T之处，P‑oligo与T‑oligo在序列上互补，所以可以形成双股的转接子。该转接子与未知序列的核酸(即目标核酸)中3’端上额外的腺嘌呤(3’‑A)接合，形成”转接子‑目标核酸”的结构。该T‑oligo接着被作为用于T oligo‑引发的聚合酶链式反应(T oligo‑primed polymerase chain reaction，TOP‑PCR)的唯一引物(primer)，藉以扩增整段未知序列的核酸分子。

技术领域

本发明主要关于DNA增殖。

背景技术

测序技术的进步已为癌症突变检测提供了一个更好的选择。第二代测序技术(Next-generation sequencing，NGS)是一种具有优越分辨率足以侦测单一核苷酸的差异的尖端技术。然而，NGS在来自循环血浆DNA(cpDNA)，其中可能带有少量的肿瘤循流DNA(circulating DNA，ctDNA)，的癌症突变分析上的应用仍处于早期阶段。这是因为在血浆内的DNA含量极低，且并无可靠的方法可以自血浆中扩增少量DNA。一般通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)的DNA扩增方式使用一个或多个成对(pair)的引物(primer)来界定目标区域(target regions)的边界以及通过嗜热性DNA聚合酶提供合成作用。

当应用于线性DNA的全长扩增时，使用成对引物的策略有本质上的缺点，因为每个目标DNA(target DNA)片段的末端必需接合两种不同的转接子(adaptors)，其会使不同的PCR引物连接而进行环状DNA扩增。因为每个目标DNA的末端具有相同的机会与任一转接子连接，一半的目标DNA片段仅与一种转接子接合，造成有50％的机会损失序列信息，因为这样的片段无法以指数速率扩增，因此在测序与下游分析时会错误地造成代表性不足。当涉及到低含量DNA分子的NGS分析时，这个问题会变得很严重，例如在单一细胞转录组(transcriptome)内的低含量分子或在体液样本内的低含量DNA分子，如血浆，其中目标DNA或RNA种类的主要部分含量都远低于测序基因库(sequencing library)的建构或一般实验室仪器定量的最低含量要求。当考虑到疾病诊断时，这问题又会变得更为严重，因为每天要检验大量的临床DNA样本，而且有各种不良因素，例如石蜡包埋、长期或不当的储存，量少或浓度低，样本少或质量差。因此，极需要一种在样本中有效且非选择性的DNA扩增方法，可把“所有”DNA/RNA分子当作目标并且扩增，而不偏好任何序列。

发明内容

本发明涉及一种称为“T-寡核苷酸引发的聚合酶链式反应(T-oligo primed PCR，TOP-PCR)”的新方法的研发。

一方面，本发明涉及一种扩增未知序列的线性、双股核酸的方法。该方法包含以下步骤：

(a)提供未知序列、线性、双股的目标核酸；

(b)将一腺嘌呤核苷酸(A)加至该未知序列的线性、双股核酸的3’-尾端使成为带有3’-腺嘌呤核苷酸(3’-A)的未知序列的核酸；

(c)提供带有5’-磷酸(5’-p)的第一股寡核苷酸(oligo)；

(d)提供带有3’-胸腺嘧啶核苷酸(3’-T)且不带有5’-磷酸(5’-p)之第二股寡核苷酸(oligo)，该带有3’-T的第二股寡核苷酸与该带有5’-p的第一股寡核苷酸在除了该第二股寡核苷酸的3’-T以外之处互补；

(e)使第一与第二股寡核苷酸退火(anneal)以产生带有3’-T突出端的同类转接子(homogeneous adaptor)；