[发明专利]羟甲基化暨甲基化长序列标签测序技术

摘要

羟甲基化暨甲基化长序列标签测序技术。本发明提供了一种检测核酸甲基化修饰和羟甲基化修饰的方法，包括如下步骤：对基因组 DNA中的5-hmC进行糖基化修饰以及对照组反应；限制性内切酶MspI酶切消化；接头A的连接；Bst DNA polymerase fragment 处理；EcoP15I或MmeI酶切；片段选择；P7接头连接；PCR扩增；PCR产物的回收；文库质控。本发明检测核酸甲基化修饰和羟甲基化修饰的方法具有如下优势：可以同时检测全基因组内几乎全部CCGG位点的不同修饰即甲基化和羟甲基化的丰度；具有高通量、高准确性并可降低实验和测序误差；不依赖于重亚硫酸盐的转换，弥补了传统甲基化检测技术中无法分辨甲基化和羟甲基化修饰的缺点。

主权项

一种检测核酸甲基化修饰和羟甲基化修饰的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：设置三组反应，其中一组对核酸进行糖基化处理，其余两组的核酸未经糖基化处理；步骤二：将步骤一中经糖基化处理后的核酸的一组和未经糖基化处理的核酸的一组分别平行进行MspI酶切反应；将步骤一中剩余的未经糖基化处理的核酸的一组同时进行HpaII酶切反应；步骤三：将步骤二中三组中的每组的酶切片段分别连接含有不同Index且同时包含Ecop15I或MmeI酶切位点的接头A，将连接有不同的接头A的各组的核酸混合到一起，得到一个包含无修饰、甲基化修饰和羟甲基化修饰的核酸文库；步骤四： 运用Bst DNA 聚合酶将核酸文库中的双链DNA接头中有缺口的一条链进行修复；步骤五：对上一步得到的核酸进行Ecop15I或MmeI酶切，产生短片段DNA序列；步骤六：回收连接接头A的短DNA片段；步骤七：将一段有两个碱基粘性末端的P7接头与步骤六的连接接头A的短DNA片段进行连接； 步骤八：以接头A和P7接头的DNA序列设计通用引物对步骤七得到的连有P7接头及接头A的短DNA片段进行PCR扩增，回收纯化PCR产物，建立测序文库；步骤九：对步骤八得到的测序文库进行测序，分析比较序列信息，获得核酸甲基化修饰和羟甲基化修饰的信息。