[发明专利]羟甲基化暨甲基化长序列标签测序技术

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，特别涉及一种羟甲基化暨甲基化长序列标签测序技术。

背景技术

5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)是早在1952年发现的存在于噬菌体中胞嘧啶的一种修饰形式，也是最近同时在小鼠的神经元和胚胎干细胞中检测到的存在于哺乳动物基因组中的又一种修饰方式。随后，大量的研究集中于揭示5hmC和TET蛋白家族氧化酶在基因组组织以及鼠干细胞分化中可能承担的角色，并且证明TET蛋白酶家族可以通过氧化作用将5mC转换为5hmC。而Tet家族酶与疾病的发展与调控有关。已报道TET蛋白和5hmC存在于许多不同的组织中，并且它们的表达/活性在胚胎干细胞分化过程中受到严格调控。TET1和TET2均与癌症有关：TET1在急性骨髓样白血病(AML)和急性淋巴样白血病(ALL)中是MLL的的一个配体，而TET2功能的缺失也与急性骨髓样白血病(AML)以及各种骨髓细胞生成障碍综合征和骨髓增生性疾病密切相关。TET蛋白和hmC引起DNA甲基化失调，在胚胎干细胞多潜能性，致癌性转化以及神经元的功能中可能具有重要作用。

然而，尽管5hmC修饰碱基早在50年前就在噬菌体中发现，然而目前几乎没有一种有效的酶或化学的方法可以特异性识别5hmC残基并分辨其在基因组中的具体分布。例如甲基化依赖性内切酶MspJI家族或McrBC均不能分辨5mC和5hmC，而甲基化敏感类内切酶如MspI或HpaII等，在大多情况下，5mC和5hmC对其有相同的影响。之前认为是检测甲基化金标准的重亚硫酸盐处理分析同样不能有效地分辨是5mC修饰还是5hmC修饰。最近随着5hmC特异性抗体的出现，依赖于免疫学检测5hmC的技术如斑点印迹分析技术、细胞免疫荧光或免疫组化分析技术等已被广泛应用于羟甲基化相关的科学研究之中,但这些技术基本上都只限于检测5hmC在组织或细胞内的存在与否或表达量的高低，而不能定位其在基因组上的分布。目前，在全基因组范围内检测5hmC分布的技术主要集中在富集捕获结合测序分析的策略，如：hMeDIP、anti-CMS、JBP-pull down等，但所有这些富集捕获的实验方法均不足以达到单碱基精确分辨5hmC在DNA序列内精确分布的程度,而且依赖于抗体或蛋白捕获的该类技术大多受到非特异性捕获以及捕获偏好性的限制。最近基于生物氧化反应建立起来的TAB-Seq和基于化学氧化建立起来的oxBS-seq可以检测全基因组的羟甲基化修饰，而且可以进行单碱基分辨，但是这两种检测方法所需要的数据量巨大且实验技术不宜在普通实验室建立，其广泛应用受到限制。

另一方面，用于检测5hmC在全基因组或不同细胞或组织中含量的检测方法却不断发展，5hmC在不同细胞或组织中含量的检测也不仅限于胚胎干细胞和脑组织中了。令人兴奋的是最新两个研究分别运用免疫组化和免疫测定的方法检测到5hmC在胚胎和成体组织均广泛存在。免疫测定发现5hmC在脑、肝、肾和结肠直肠组织中的百分含量比较高为0.40-0.65％，而在肺组织中含量相对较低为0.18％，在心脏，乳房和胎盘中的含量极低，仅为0.05-0.06％。相对正常结肠直肠组织0.46-0.57％的百分含量，该研究同样检测发现在癌变的结肠直肠组织中其含量仅为0.02-0.06％。这表明更亟待需要建立一种能够精确检测5hmC在基因组范围内精确分布的大规模检测技术，为进一步研究5-羟甲基胞嘧啶在基因组内的分布及其相关的表观调控机制提供一种有力的工具，也为进一步探索其对相关疾病的发生发展或在个体发育过程中所承担角色的实现提供前提条件。