[发明专利]羟甲基化暨甲基化长序列标签测序技术

权利要求书

1.一种检测核酸甲基化修饰和羟甲基化修饰的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：设置三组反应，其中一组对核酸进行糖基化处理，其余两组的核酸未经糖基化处理；

步骤二：将步骤一中经糖基化处理后的核酸的一组和未经糖基化处理的核酸的一组分别平行进行MspI酶切反应；将步骤一中剩余的未经糖基化处理的核酸的一组同时进行HpaII酶切反应；

步骤三：将步骤二中三组中的每组的酶切片段分别连接含有不同Index且同时包含Ecop15I或MmeI酶切位点的接头A，将连接有不同的接头A的各组的核酸混合到一起，得到一个包含无修饰、甲基化修饰和羟甲基化修饰的核酸文库；

步骤四： 运用Bst DNA 聚合酶将核酸文库中的双链DNA接头中有缺口的一条链进行修复；

步骤五：对上一步得到的核酸进行Ecop15I或MmeI酶切，产生短片段DNA序列；

步骤六：回收连接接头A的短DNA片段；

步骤七：将一段有两个碱基粘性末端的P7接头与步骤六的连接接头A的短DNA片段进行连接； 

步骤八：以接头A和P7接头的DNA序列设计通用引物对步骤七得到的连有P7接头及接头A的短DNA片段进行PCR扩增，回收纯化PCR产物，建立测序文库；

步骤九：对步骤八得到的测序文库进行测序，分析比较序列信息，获得核酸甲基化修饰和羟甲基化修饰的信息。

2.根据权利要求1所述的检测核酸甲基化修饰和羟甲基化修饰的方法，其特征在于，步骤一中所述的核酸为基因组DNA。

3.根据权利要求1所述的检测核酸甲基化修饰和羟甲基化修饰的方法，其特征在于，步骤一中所述的糖基化处理为：核酸在T4- BGT酶的作用下，以尿嘧啶二磷酸葡萄糖为底物，将葡萄糖单元转移至核酸的5-羟甲基胞嘧啶上，形成β-葡糖基-5-羟甲基胞嘧啶。

4.根据权利要求1所述的检测核酸甲基化修饰和羟甲基化修饰的方法，其特征在于，所述接头A序列为三对：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2；SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4；SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。

5.根据权利要求1所述的检测核酸甲基化修饰和羟甲基化修饰的方法，其特征在于，所述P7接头序列为SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8。

6.根据权利要求1所述的检测核酸甲基化修饰和羟甲基化修饰的方法，其特征在于，所述步骤八中的进行PCR扩增所用的通用引物为SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10。

7.一种用于检测核酸甲基化修饰和羟甲基化修饰的试剂盒，其特征在于，包括如下组分：

（1）用于进行糖基化修饰的试剂；

（2）限制性内切酶，

（3）含有不同Index的接头A， 

（4）Bst DNA 聚合酶；

（5）一段有两个碱基粘性末端的P7接头；

（6）根据接头A的DNA序列设计的通用引物；

（7）根据P7接头的DNA序列设计通用引物。

8.根据权利要求7所述的用于检测核酸甲基化修饰和羟甲基化修饰的试剂盒，其特征在于，所述用于进行糖基化修饰的试剂为T4 β-葡萄糖基转移酶。

9.根据权利要求8所述的用于检测核酸甲基化修饰和羟甲基化修饰的试剂盒，其特征在于，所述限制性内切酶为包括MspI、HpaII以及EcoP15I，或者包括MspI、HpaII以及MmeI。

10.根据权利要求9所述的用于检测核酸甲基化修饰和羟甲基化修饰的试剂盒，其特征在于，所述接头A序列同时包含Ecop15I或MmeI酶切位点，为三对：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2；SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4；SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6；所述P7接头为SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8；所述根据接头A的DNA序列设计的通用引物为SEQ ID NO：9，所述根据P7接头的DNA序列设计通用引物为SEQ ID NO：10。