[发明专利]甲基化CpG岛的高通量测序检测方法

摘要

甲基化CpG岛的高通量测序检测方法，包括用修饰剂处理DNA样品，将DNA样品中的胞嘧啶转换为尿嘧啶，而5’甲基胞嘧啶不变；所得片段用引物A和DNA聚合酶扩增，获得一端能够锚定接头引物C的片段；所得片段用引物B和DNA聚合酶扩增，获得富集甲基化CpG岛且两端能够分别锚定接头引物C和D的片段；所得片段用接头引物C、D和DNA聚合酶进行PCR指数扩增，获得扩增产物；扩增产物分离纯化，构成高通量测序文库、上机测序及数据分析。在高CpG频率引物对修饰剂转换的基因组DNA中的甲基化CpG岛进行富集性扩增的同时通过三步PCR反应将接头序列连接到待测目的片段，以富集甲基化CpG岛及构建高通量测序文库。

主权项

一种甲基化CpG岛的高通量测序检测方法，其特征在于，包括下列步骤：步骤一、用修饰剂处理DNA样品，以便将DNA样品中的胞嘧啶转换为尿嘧啶，而5’甲基胞嘧啶不变，获得经过转换的DNA片段；步骤二、将所述经过转换的DNA片段用引物A和DNA聚合酶进行至少1次线性扩增，以便获得一端能够锚定接头引物C的目的片段；其中所述引物A由3’端和5’端两部分组成，其中所述3’端部分用于结合和扩增所述经过转换的DNA片段，其特征为，长度大于或等于4个核苷酸且能结合所述经过转换的DNA片段；其中所述引物A的5’端部分用于锚定接头引物C，其特征为，其反向互补序列能够被接头引物C结合并进行聚合酶链式反应(PCR)扩增；步骤三、将所述一端能够锚定接头引物C的目的片段用引物B和DNA聚合酶进行扩增，以便获得富集甲基化CpG岛且两端能够分别锚定接头引物C和接头引物D的目的片段；其中所述引物B由3’端和5’端两部分组成，其中所述3’端部分用于结合所述一端能够锚定接头引物C的目的片段并富集性扩增甲基化CpG岛，其特征为：1)长度大于或等于7个核苷酸；2)高CpG频率，其所述高CpG频率一是指3’端起前7个核苷酸中包含2个或3个CpG；3)高GC含量，其所述高GC含量是指3’端起前10个核苷酸中C与G之和大于或等于7个，使其退火温度达到40度至60度之间；其中所述引物B的5’端部分用于锚定接头引物D，其特征为，其反向互补序列能够被接头引物D结合并进行PCR扩增；步骤四、将所述富集甲基化CpG岛且两端能够分别锚定接头引物C和接头引物D的目的片段用接头引物C、接头引物D和DNA聚合酶进行PCR指数扩增，以便获得扩增产物；步骤五、将所述扩增产物进行分离纯化，所述扩增产物构成高通量测序文库；以及，将所述高通量测序文库上机测序及数据分析。