[发明专利]甲基化CpG岛的高通量测序检测方法

权利要求书

1.一种甲基化CpG岛的高通量测序检测方法，其特征在于，包括下列步骤：

步骤一、用修饰剂处理DNA样品，以便将DNA样品中的胞嘧啶转换为尿嘧啶，而5’甲基胞嘧啶不变，获得经过转换的DNA片段；

步骤二、将所述经过转换的DNA片段用引物A和DNA聚合酶进行至少1次线性扩增，以便获得一端能够锚定接头引物C的目的片段；

其中所述引物A由3’端和5’端两部分组成，其中所述3’端部分用于结合和扩增所述经过转换的DNA片段，其特征为，长度大于或等于4个核苷酸且能结合所述经过转换的DNA片段；

其中所述引物A的5’端部分用于锚定接头引物C，其特征为，其反向互补序列能够被接头引物C结合并进行聚合酶链式反应(PCR)扩增；

步骤三、将所述一端能够锚定接头引物C的目的片段用引物B和DNA聚合酶进行扩增，以便获得富集甲基化CpG岛且两端能够分别锚定接头引物C和接头引物D的目的片段；

其中所述引物B由3’端和5’端两部分组成，其中所述3’端部分用于结合所述一端能够锚定接头引物C的目的片段并富集性扩增甲基化CpG岛，其特征为：1)长度大于或等于7个核苷酸；2)高CpG频率，其所述高CpG频率一是指3’端起前7个核苷酸中包含2个或3个CpG；3)高GC含量，其所述高GC含量是指3’端起前10个核苷酸中C与G之和大于或等于7个，使其退火温度达到40度至60度之间；

其中所述引物B的5’端部分用于锚定接头引物D，其特征为，其反向互补序列能够被接头引物D结合并进行PCR扩增；

步骤四、将所述富集甲基化CpG岛且两端能够分别锚定接头引物C和接头引物D的目的片段用接头引物C、接头引物D和DNA聚合酶进行PCR指数扩增，以便获得扩增产物；

步骤五、将所述扩增产物进行分离纯化，所述扩增产物构成高通量测序文库；以及，

将所述高通量测序文库上机测序及数据分析。

2.根据权利要求1所述的方法，所述修饰剂为亚硫酸氢盐。

3.根据权利要求1所述的方法，所述引物A的3’端部分特征为，除了CpG以外，引物只包含C、A和T；所述引物B的3’端部分特征为，除了CpG以外，引物只包含G、A和T。

4.根据权利要求1～3任一项所述的方法，所述引物A的3’端第二个核苷酸为C。

5.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其中所述引物A的3’端部分用于结合和扩增经过转换的DNA片段并初步富集甲基化CpG岛，其特征为中等CpG频率，其所述中等CpG频率是指引物3’端起前7个核苷酸中包含1个CpG。

6.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其中所述引物A的3’端部分用于结合和扩增经过转换的DNA片段并初步富集甲基化CpG岛，其特征为高C频率，其所述高C频率是指3’端起前5个核苷酸中至少包含3个C。

7.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其中所述引物A的3’端部分用于结合和扩增经过转换的DNA片段并初步富集甲基化CpG岛，其特征为高CpG频率，其所述高CpG频率是指3’端起前7个核苷酸中包含2个或3个CpG。

8.根据权利要求1～3任一项所述的方法，所述引物B的3’端部分特征为极高CpG频率，其所述极高CpG频率是指3’端7个核苷酸中包含3个CpG。

9.根据权利要求1～3任一项所述的方法，所述步骤二中的DNA聚合酶具有链置换功能。

10.根据权利要求1～3任一项所述的方法，所述步骤二中的DNA聚合酶是外切核酸酶缺损的。

11.根据权利要求1～3任一项所述的方法，所述步骤二进行2～30次线性扩增。

12.根据权利要求1～3任一项所述的方法，所述步骤三中的DNA聚合酶是热启动的。