[发明专利]甲基化CpG岛的高通量测序检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及利用高通量测序技术检测基因组中的甲基化CpG岛。

背景技术

DNA甲基化是指在DNA上的胞嘧啶(C)的第5个碳原子上被甲基共价修饰成为5’甲基胞嘧啶(5mC)，它具有多种重要的生物学功能，包括转录调控，转座子沉默、基因印记和X染色体失活等，一直是分子生物学领域的一个研究热点。在包括人类在内的脊椎动物中，DNA甲基化修饰绝大多数发生在CpG位点上(CpG表示核苷酸对，其中鸟嘌呤(G)在DNA链上紧随C后)。CpG在脊椎动物基因组中的平均含量低于预期概率，但在基因组某些区段，CpG保持或高于正常概率，这些区段被称作CpG岛。CpG岛主要位于基因启动子，在人类基因组中，约有3万个CpG岛，其中50％以上位于启动子，而60％以上的基因启动子含有CpG岛。启动子CpG岛一旦被甲基化将导致相应基因表达沉默，已有研究表明这种机制参与了多种生理过程的调控，包括X染色体失活、基因印记、胚胎干细胞分化、生殖细胞发育以及肿瘤的发生和发展。基因内和基因间的CpG岛可能是尚未鉴定的启动子。全面理解CpG岛甲基化的生物学功能需要系统和高效的检测技术。

传统检测DNA甲基化的方法，包括限制性酶切、限制性酶切-PCR、甲基化特异性PCR，只能检测单个或少数位点。近年来，随着高通量测序技术的发展，人们开始能够系统地从全基因组水平了解DNA甲基化谱式。目前基于高通量测序技术的DNA甲基化检测方法包括：1)甲基化DNA免疫沉淀；2)甲基化CpG免疫沉淀和3)亚硫酸氢盐测序(Bisulfite Sequencing)。前二者采用抗体或重组甲基化CpG结合蛋白捕获甲基化DNA，随后进行高通量测序，这两种方法只能对DNA甲基化状态进行半定量检测，其分辨率为100bp左右。亚硫酸氢盐测序的原理是亚硫酸氢盐处理能使得DNA上的C转变成为尿嘧啶(U)，而5mC则不受影响，因此随后进行高通量测序就可以得知DNA上的甲基化修饰情况。这种方法的分辨率精确到单个碱基，是DNA甲基化分析的金标准。2009年第一次报道了亚硫酸氢盐测序获得的单碱基分辨率人类全基因组甲基化图谱。但是，由于这种技术是对全基因组进行测序，费用非常高，阻碍其应用于大量样本的检测。随后有研究者提出了简化代表性亚硫酸氢盐测序(Gu H，et al.Preparation of reduced representation bisulfite sequencing libraries for genome-scale DNA methylation profiling.Nat Protoc.20116(4)：468-81.)，这种方法通过Mspl酶切、跑胶、纯化步骤富集启动子及CpG岛区域，随后进行末端修复、加A、接头连接、片段选择纯化和PCR扩增等步骤构建测序文库，虽然比全基因组亚硫酸氢盐测序更加经济和高效，但是文库构建过程繁琐，需要大约5～6天时间，而且富集过程不能区分甲基化和非甲基化CpG岛，增加了测序成本。专利(高通量测序文库的构建方法及其应用，CN103103624A)利用特异性探针捕获包括CpG岛在内的目的片段，然后进行亚硫酸氢盐测序，但序列捕获和文库构建过程同样相当费时。

因此，目前尚缺乏一种高效的甲基化CpG岛高通量测序检测方法。

发明内容

本发明方法通过高CpG频率引物对修饰剂转换的基因组DNA中的甲基化CpG岛进行富集性扩增，同时通过三步PCR反应将接头序列连接到待测目的片段，得以高效地富集甲基化CpG岛及快速地构建高通量测序文库，是一种新颖、高效和经济的甲基化CpG岛高通量测序检测方法。

在第一方面，本发明提供了甲基化CpG岛的高通量测序检测方法，包括下列步骤：

步骤一、用修饰剂处理DNA样品，以便将DNA样品中的胞嘧啶转换为尿嘧啶，而5’甲基胞嘧啶不变，获得经过转换的DNA片段。

DNA可以是任何包含脱氧核苷酸的聚合物。优选地，所述DNA样品为基因组DNA，来源于动物、植物和微生物中至少一种，优选所述动物为人和小鼠中至少一种。

所述DNA样品可以来自人的细胞、组织、血液、体液、尿液、排泄物或其组合；在一个优选的形式中，所述DNA样品来自人的血浆或血清游离DNA；任选地，所述DNA样品来自人的全血基因组DNA；任选地，所述DNA样品来自人的肿瘤细胞株；