[发明专利]一种miRNA分子标记的制备方法

摘要

本发明公开了一种miRNA分子标记的制备方法，其步骤是：1）用已知的128个SRAP引物与23个保守的pre-miRNA引物，利用两两组合的方式对鄂棉22和海岛棉品系3-79两个亲本进行多态性筛选；2）两个亲本杂交获得F1代，然后用鄂棉22做父本回交获得BC1群体；3）提取两个亲本，F1代和BC1群体的gDNA；4）用步骤1）中筛选出的多态性引物对3）中的gDNA进行多态性筛选；5）记录扩增产物信息；6）利用作图软件获得pre-miRNA的染色体定位。方法易行，操作简便，费用低廉，能高效快捷的发掘miRNA分子标记，而且由于SRAP引物设计的特点，所得的miRNA标记可能为功能基因，对今后miRNA的研究具有一定的参考价值。

主权项

一种miRNA分子标记的制备方法，其步骤是：（1）用已知的128个SRAP引物与23个保守的pre‑miRNA引物，利用两两组合的方式：共计2944对引物，通过常规电泳方法对鄂棉22和海岛棉品系3‑79两个亲本进行三次多态性筛选，挑选出稳定的多态性标记组合，得到55对亲本间呈多态性的SSR引物，引物多态性率为1.87%；（2）以陆地棉品种鄂棉22为母本，海岛棉品系3‑79为父本，杂交得F1，后用鄂棉22给F1授粉得含141个单株的海陆种间BC1群体；（3）采集步骤（2）中BC1群体的各单株的叶片和鄂棉22、海岛棉品系3‑79以及F1的叶片，提取gDNA；（4）以两亲本鄂棉22和海岛棉品系3‑79、F1、141个BC1单株共144个个体的DNA为模板，用步骤（1）中筛选出的55对多态性引物进行PCR扩增，扩增产物用6%V/V变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳；（5）记录下各引物扩增产物在6%V/V变性聚丙烯酰胺凝胶上的多态性信息，具体如下：对于共显性标记，用A表示母本鄂棉22的纯合带型，用B表示父本海岛棉品系3‑79的纯合带型，用H表示两亲本的杂合带型；数据缺失用‑表示；（6）在构建高密度海陆种间图谱所用的多态性标记的基础上，结合步骤（1）筛选出的中的55对多态性标记，利用JoinMap3.0为作图软件，LOD值设为5.0，并用Kosambi函数将重组率转换为遗传图距，最后用MapChart V2.2 software软件绘制出遗传连锁图谱，获得pre‑miRNA的染色体定位。