[发明专利]一种miRNA分子标记的制备方法

权利要求书

1.一种miRNA分子标记的制备方法，其步骤是：

（1）用已知的128个SRAP引物与23个保守的pre-miRNA引物，利用两两组合的方式：共计2944对引物，通过常规电泳方法对鄂棉22和海岛棉品系3-79两个亲本进行三次多态性筛选，挑选出稳定的多态性标记组合，得到55对亲本间呈多态性的SSR引物，引物多态性率为1.87%；

（2）以陆地棉品种鄂棉22为母本，海岛棉品系3-79为父本，杂交得F1，后用鄂棉22给F1授粉得含141个单株的海陆种间BC1群体；

（3）采集步骤（2）中BC1群体的各单株的叶片和鄂棉22、海岛棉品系3-79以及F1的叶片，提取gDNA；

（4）以两亲本鄂棉22和海岛棉品系3-79、F1、141个BC1单株共144个个体的DNA为模板，用步骤（1）中筛选出的55对多态性引物进行PCR扩增，扩增产物用6%V/V变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳；

（5）记录下各引物扩增产物在6%V/V变性聚丙烯酰胺凝胶上的多态性信息，具体如下：对于共显性标记，用A表示母本鄂棉22的纯合带型，用B表示父本海岛棉品系3-79的纯合带型，用H表示两亲本的杂合带型；数据缺失用-表示；

（6）在构建高密度海陆种间图谱所用的多态性标记的基础上，结合步骤（1）筛选出的中的55对多态性标记，利用JoinMap3.0为作图软件，LOD值设为5.0，并用Kosambi函数将重组率转换为遗传图距，最后用MapChart V2.2 software软件绘制出遗传连锁图谱，获得pre-miRNA的染色体定位。