[发明专利]一种miRNA分子标记的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于棉花分子育种技术领域，更具体涉及一种miRNA分子标记的制备方法，方法易行，操作简便，费用低廉，能高效快捷的发掘miRNA分子标记，而且由于SRAP引物设计的特点，所得的miRNA标记可能为功能基因。

背景技术

MicroRNA是一类内源性的非编码小分子RNA,，长约20～25nt，miRNA基因的前体是约为70nt的茎环结构的RNA分子（Barte et al.1997；Lai et al.2003），它经过核糖核酸酶Ⅲ(Dicer)的剪切加工，形成长约22nt的单链miRNA分子，几乎所有的miRNA都是从前体的一条臂上加工而来，只有极少数的个例可以从前体的两条臂上同时产生miRNA（Lee,Y.et al.2003）。microRNA基因以单拷贝、多拷贝或基因簇等多种形式存在于基因组中，而且绝大部分落于基因间隔区，说明它们的转录独立于其他的基因，具有本身的转录调控机制。在植物细胞中,它参与了基因的转录与表达，主要通过与靶基因mRNA的特定位点结合，抑制蛋白的合成或诱导mRNA的降解而起作用。

自2002年miRNA在植物中发现以后，植物中越来越多的miRNA相继被报道，由于其在植物和动物的生命活动过程中起着重要的调控作用而受到越来越广泛的关注。miRNA作为一种调节分子广泛的参与到动植物的发育中，研究发现，植物miRNA作用的目的mRNA大都编码转录因子，这些转录因子与分生组织的特性、细胞的分裂、器官的分离、器官的极性相关，而且某些转录因子可能与棉花纤维的发育与伸长有关，因此miRNA的研究对于提高棉花产量和改善纤维品质具有重要的意义。

在2002年，miRNA被Science杂志评为十大科技突破第一名，目前miRNA成为研究的热点之一，但到目前为止对miRNA进行分子标记开发的文章却很少，仅2011年Pang发表的Comparative expression of miRNA genes and miRNA-based AFLP marker analysis in cultivated tetraploid cottons一篇。AFLP以其精确有效的特点得到了广泛的应用，但是，其步骤相对复杂，需要经过DNA消化、连接、扩增等多步反应，各步的反应条件很难控制，出现假阳性机率较高，并且AFLP技术受到专利保护试剂盒昂贵，成本较高，而且对DNA的纯度和内切酶的质量要求较高。AFLP谱带多，但分析程序复杂、成本高有时要用到同位素，识别AATT位点的MseI酶常会引起一些物种基因组中标记分布不均衡，基因组不完全酶切，染色体聚集，这在一定程度上限制了它们的发展。基于此背景本实验利用miRNA保守序列设计的简并引物与SRAP引物进行组合开发miRNA分子标记，希望能高效快捷的发掘更多的miRNA分子标记。

SRAP标记具有简便、稳定、中等产率、可产生共显性标记、便于克隆测序目标片段的特点，因此兼具AFLP的多态性高、产率中等、重复性好和RAPD的操作简单等优点。被广泛应用于生物遗传多样性分析、种质鉴定、遗传连锁图的构建和比较基因组学等方面，SRAP标记引物设计原理是利用基因外显子里GC含量丰富，而启动子和内含子里AT含量丰富的特点而设计的引物，对开放阅读框架进行扩增，因此本miRNA分子标记开发方法所得标记可能为功能标记，对miRNA的研究具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种miRNA分子标记的制备方法，利用miRNA保守序列引物与SRAP引物（Sequence-related amplifed polymorphism）进行组合制备miRNA分子标记，方法易行，操作简便，能高效快捷的发掘miRNA分子标记，而且由于SRAP引物设计的特点，所得的miRNA标记可能为功能基因，对今后miRNA的研究具有一定的参考价值。

为了实现以上目的，本发明通过以下技术方案实现：

一种miRNA分子标记的制备方法，其步骤是：